[发明专利]一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法

权利要求书

1.一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：

工程菌直接发酵转化法，包括7α-HSDH和7β-HSDH基因密码子优化、工程菌的构建、工程菌培养、底物的转化及产物制备；所述工程菌为同时表达7α-HSDH和7β-HSDH基因的大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21star(DE3)；所述底物为牛磺鹅去氧胆酸。

2.根据权利要求1的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：

7α-HSDH和7β-HSDH分别为7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶；

两个7α-HSDH分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和大肠杆菌(Escherichia coli strain TW14359，GenBank登录号：CU928163.2)，

两个7β-HSDH基因分别来源于:撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense strain DSM599，GenBank登录号：JN191345.1)和活泼瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus strain N53，GenBank登录号：KF052988.1)，

分别采用http://www.jcat.de/在线软件以大肠杆菌为宿主菌，根据密码子偏好性，对全基因序列进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α1、α2、β1、β2。

3.根据权利要求1的一种牛磺熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：，包括如下具体步骤：

a)双基因表达载体构建

①两个7α-HSDH和两个7β-HSDH分别进行密码子优化，并进行全基因合成，分别记为α₁、α₂、β₁、β₂；

②合成的四个基因各自双酶切并分别连接入pETM6载体，得pETM6-α₁、pETM6-α₂、pETM6-β₁、pETM6-β₂；

③将pETM6-α₁、pETM6-α₂、pETM6-β₁、pETM6-β₂分别进行酶切连接，得到pETM6-α₁β₁、pETM6-α₁β₂、pETM6-α₂β₁、pETM6-α₂β₂。

b)多基因表达载体构建

在pETM6-α1β1、pETM6-α1β2、pETM6-α2β1、pETM6-α2β2重组载体的基础上，分别酶切重组载体和pETM6-β1、pETM6-β2，再次连接β基因，得到pETM6-α1β1β1、pETM6-α1β1β2、pETM6-α1β2β2、pETM6-α2β1β1、pETM6-α2β1β2、pETM6-α2β2β2；

c)工程菌的构建

①将pETM6-α₁β₁、pETM6-α₁β₂、pETM6-α₂β₁、pETM6-α₂β₂分别转入大肠杆菌BL21star感受态细胞，得到四个带有双基因表达载体的工程菌

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₂；

pETM6空载体转入大肠杆菌，得到E.coli BL21star-pETM6，作为载体对照工程菌；

②将pETM6-α₁β₁β₁、pETM6-α₁β₁β₂、pETM6-α₁β₂β₂、pETM6-α₂β₁β₁、pETM6-α₂β₁β₂、pETM6-α₂β₂β₂分别转入大肠杆菌BL21star感受态细胞，得到六个带有多基因表达载体的工程菌

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₁β₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₁β₁、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₁β₂、

E.coli BL21star-pETM6-α₂β₂β₂；

d)工程菌的培养

①将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于20～40℃活化培养1～7天；

②从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于加有附加50～100mg/L氨苄青霉素(Amp⁺)LB液体培养基的三角瓶中，在75～225rpm/min、20～40℃下震荡培养12～24小时；

③将上述培养物按1:50比例接种到液体M9培养基，在75～225rpm/min、20～40℃下震荡培养3～5小时，加入0.1～1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，继续培养3～5小时；

e)底物发酵转化

①将上述培养物离心，收集菌体，以5～20倍浓缩至新的附加50～100mg/L的Amp+、0.1～1mM的IPTG的M9培养基；

②添加底物，于75～225rpm/min、20～40℃下震荡培养1～3天，进行底物的发酵转化；

f)牛磺熊去氧胆酸制备

①发酵过程结束，收集转化液，用等体积的正丁醇分三次反复萃取，合并萃取液，减压浓缩挥干正丁醇；

②所得残渣用乙醇溶解后，再次减压浓缩挥干，所得干燥物即为以牛磺熊去氧胆酸为主要成分的转化产物；

③取部分干燥物用甲醇水溶解，0.22μm滤膜过滤，用XBridgeTM C18 5μm色谱柱，对转化后成分进行分析。