[发明专利]回输临床治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞体外三维分离培养保存方法

权利要求书

1.一种临床治疗级细胞治疗用人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞制备方法，由以下步骤组成；(1)人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组合；(2)筛选用叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质制备；(3)应用叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质与人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组合筛选培养人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞，以及人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞长期冻融保存液制备。

2.一种利用权利要求1所述的人胎盘叶状绒毛膜来源的间充质干细胞培养液组合包括：

配制培养液A：胎盘多肽注射液0.05ml/L、EGF5～25ng/ml、干细胞生长因子(SCF)2～11ng/ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B40.5～1mg/L、维生素C1～4μg/ml、胰岛素5～8μg/ml、青霉素50～100u/ml、链霉素100u/mL、氢化可的松0.4μg/ml、商用培养基-低糖DMEM/F12(3:1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4；

配制培养液B：胎盘多肽注射液0.1ml/L、人血清白蛋白(HSA)1～3g/L、人血纤粘蛋白(FN)1～5μg/L、人层粘连蛋白(LN)5～10μg/L、血小板衍生因子(PDGF)1～10mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)1～6mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)1～6μg/L、EGF5～10ng/ml、维生素B1～5mg/L、叶酸1～10ng/ml、维生素E0.05～1mg/L、维生素B40.5～1mg/L、黄体酮0.01～0.04μg/L、辅酶Q100.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、腺苷10～15ng/ml、胰岛素5～6μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4；

配制培养液C:人胎盘组织液0.01～0.3ml/L、人血清白蛋白(HSA)0.1～6g/L、人血纤粘蛋白(FN)3～25μg/L、人层粘连蛋白(LN)10～60μg/L、重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)1～4mg/L、血小板衍生因子(PDGF)10～20mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)6～10mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)6～10μg/L、重组人肝细胞生长因子(HGF)5～20mg/L、EGF、bFGF10～25mg/L、重组人脑源性神经营养因子(BDNF)15～40ng/ml、维生素B1～4mg/L、叶酸1～15ng/ml、黄体酮0.01～0.06μg/L、维生素E0.05～1.2mg/L、维生素C0.1～10mg/L、维生素B40.1～0.5mg/L、辅酶Q100.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、还原性谷胱甘肽3～6μg/L、油酸0.5～7.5mg/L、转铁蛋白6～20mg/L、腺苷10～25ng/ml、胰岛素5～7mg/L、多聚赖氨酸4～6mg/L、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4。

3.一种利用权利要求1所述筛用叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质制备方法，包括其中所述的叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质；制备包括以下步骤：A)叶状绒毛膜组织消毒处理；B)叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质脱细胞处理；C)将消毒或经脱细胞处理的叶状绒毛膜高拟体内细胞外基质进一步进行低温、脱水、辐照灭菌处理；其中所述步骤B)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶－非离子表面活性剂－络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合EDTA交联液法。