[发明专利]组织工程用人胎盘羊膜来源的间充质干细胞种子细胞筛选培养冻存技术方法

权利要求书

1.一种临床治疗级细胞治疗用人胎盘羊膜来源的间充质干细胞制备方法，由以 下步骤组成；

(1)人胎盘羊膜来源的间充质干细胞培养液组合；(2)筛选用羊膜层高拟体 内细胞外基质制备；(3)应用羊膜层高拟体内细胞外基质与人胎盘羊膜来源 的间充质干细胞培养液组合筛选培养人胎盘羊膜来源的间充质干细胞,以及 人胎盘羊膜来源的间充质干细胞长期冻融保存液制备。

2.一种利用权利要求1所述的人胎盘羊膜来源的间充质干细胞培养液组合包括：

配制培养液A：胎盘多肽注射液0.06ml/L、EGF5～25ng/ml、干细胞生长 因子(SCF)2～11ng/ml、转铁蛋白5～15μg/ml、维生素B40.5～1mg/L、维生素 C1～4μg/ml、胰岛素5～8μg/ml、青霉素50～100u/ml、链霉素100u/mL、氢 化可的松0.4μg/ml、商用培养基-低糖DMEM/F12(3:1)定容到500ml，PH控制在 7.2～7.4；

配制培养液B：胎盘多肽注射液0.2ml/L、人血清白蛋白(HSA)1～3g/L、人 血纤粘蛋白(FN)1～5μg/L、人层粘连蛋白(LN)5～10μg/L、血小板衍生因子 (PDGF)1～10mg/L、胎盘生长因子(rhPIGF)1～6mg/L、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)1～6μg/L、EGF5～10ng/ml、维生素B1～5mg/L、叶酸1～10ng/ml、维生 素E0.05～1mg/L、维生素B40.5～1mg/L、黄体酮0.01～0.04μg/L、辅酶Q 100.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、 胰岛素5～6μg/ml、青霉素100u/ml、链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与 商用培养基F12(1：1)定容到500ml。PH控制在7.2～7.4；

配制培养液C:胎盘多肽注射液0.02～0.8ml/L、人血清白蛋白(HSA)0.1～ 6g/L、人血纤粘蛋白(FN)3～25μg/L、人层粘连蛋白(LN)10～60μg/L、重组 人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)1～4mg/L、血小板衍生因子(PDGF)10～20mg/L、 胎盘生长因子(rhPIGF)6～10mg/L、血管内皮细胞生长因子(VEGF)6～10μg/L、 重组人肝细胞生长因子(HGF)5～20mg/L、EGF、bFGF10～25mg/L、重组人脑源性 神经营养因子(BDNF)15～40ng/ml、维生素B1～4mg/L、叶酸1～15ng/ml、黄体 酮0.01～0.06μg/L、维生素E0.05～1.2mg/L、维生素C0.1～10mg/L、维生 素B40.1～0.5mg/L、辅酶Q100.1～2mM/L、胆固醇1～10mg/L、牛磺酸0.1～ 0.4g/L、肝素钠0.1～0.3g/L、还原性谷胱甘肽3～6μg/L、油酸0.5～7.5mg/L、 转铁蛋白6～20mg/L、胰岛素5～7mg/L、多聚赖氨酸4～6mg/L、青霉素100u/ml、 链霉素100u/mL、商用培养基低糖DMEM与商用培养基F12(1：1)定容到500ml。 PH控制在7.2～7.4。

3.一种利用权利要求1所述筛用羊膜层高拟体内细胞外基质制备方法，包括

其中所述的羊膜层高拟体内细胞外基质；制备包括以下步骤：A)叶状绒 毛膜组织消毒处理；B)羊膜层高拟体内细胞外基质脱细胞处理；C)将消毒或 经脱细胞处理的羊膜层高拟体内细胞外基质进一步进行低温、脱水、辐照灭 菌处理；其中所述步骤B)的脱细胞方法选自冷酶交联剂法、酶－非离子表 面活性剂－络合剂联合法、络合剂加盐-阴离子表面活性剂法或胰酶联合 EDTA交联液法。