[发明专利]一种基于高通量测序的微生物群落组成的方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息学分析技术领域，尤其涉及一种微生物基因组16SrRNA高可变区V6区域的分类方法和装置。

背景技术

为了微生物群体的种类及丰度的传统方法包括：直接对微生物进行培养，变性梯度凝胶电泳、末端限制性内切酶片段长度多态性、焚光原位杂交、对可能的微生物种类进行PCR(聚合酶链式反应)；但这些方式都只能揭露环境中很小一部分微生物种类。如果能进行宏基因组的分析，通过直接对环境中的微生物群体进行基因组研究，得到一个比较全面的微生物种类目录，将有助于对微生物群体的后续研究和应用。

原核生物中16S rRNA(核蛋白核糖核酸，ribosomal RNA)的序列一方面在整体上高度保守，同时含有种间差异的高变异区(V1-V7)，因此该基因医疗可精确指示细菌之间的亲缘关系及其进化关系，易操作，适用于各级分类单元；所以在微生物基因组的研究中，16SrRNA测序是最常用的聚类和分类方法。但传统的基因测序是通过Sanger技术测定16S rRNA基因序列，这个技术一般得到至少500bp的读长，能帮助我们去精准地研究每一条序列的物种来源，但它容易产生嵌合体，而且测序成本比较高，费时又费力。

随着新开发出的测序技术以及测序成本的逐步降低，基因组的研究变得越来越实用，所涉及的技术包括Pyrosequencing、Solexa等。对于这些革命性的技术的一个主要挑战就是读长太短，无法对每个个体的16S rRNA进行测序，因而它的测序信息不足以让我们去精准地对微生物进行分类。但测定16S rRNA的变异区可用来来对微生物进行分类，通过设计特定的通用引物对16S可变区进行特定的PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)，然后用测序仪测序，建立在这种方法上的系统树显示了很好的生物多样性，但它的测序成本高，虽然是传统毛细管测序法费用的1/10，但却是其他新一代测序仪测序费用的10倍左右。

综上所述，提供一种更加准确地对微生物进行聚类分析的方法且方便快捷、成本低廉成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种基于16S rRNA基因高可变区V6的微生物分类方法和装置，通过对16SrRNA的高可变区V6区进行Solexa测序，并通过对这些16S rRNA可变区的短序列进行系统分类，可以在成本低廉的基础上准确反映物种的丰度信息。

本发明的第一方面提供了一种基于16S rRNA基因高可变区V6的分类方法，该方法包括：提取微生物样品中的脱氧核糖核酸(DNA)；对提取DNA的宏基因组16S rRNA核糖体核糖核酸(rRNA)的高可变区(V6)进行扩增，得到作为扩增产物的DNA片段；对DNA片段进行PCR-Free Solexa建库，建库过程中在DNA片段上加上标签序列以对每个样品进行标记；将各个样品的带有标签序列的DNA片段进行混合，使用Solexa测序工具对混合后的 DNA片段进行测序，得到按照标签区分的测序读长；利用读长的重叠关系组装得到高可变区V6的全长序列；对全长序列进行分类分析，以实现对微生物群体的分类。

优选地，该方法还包括：在步骤“提取微生物样品中的脱氧核糖核酸DNA”之前，执行微生物群体的取样。

优选地，所述对全长序列进行分类分析包括：计算全长序列序列差异度；根据序列差异度执行操作分类学单元OTU的分类，将全长序列(Unique reads)分配到OTU中；将每一个OTU分类中的全长序列比对到16S rRNA的V6数据库中，将比对结果根据众数原则对OTU进行物种注释。

优选地，根据序列差异度执行操作分类学单元(OTU)的分类是指根据本领域公知的OTU分类中“种”水平之间的差异度将全长序列分配到相应的OTU中。在本发明的一个实施方案中，将序列差异度在3％以内的全长序列(unique reads)分配到一个OTU中。

优选地，将比对结果根据众数原则对OTU进行物种注释是指如果一个OTU中66％以上的比对结果均为同一个物种，则将该OTU注释为该物种；如果未达到该比例，则将物种分类信息上移一个水平(例如从“种”上移到“属”，或从“属”继续上移到“科”)再进行统计，直到达到66％的比例标准为止。

优选地，该方法还包括：在步骤“对全长序列进行分类分析”之后，基于分类分析结果，进行种群多样性分析和/或统计得到微生物群体的相对丰度值。