[发明专利]一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其血清学鉴别方法

说明书

本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗及其制备方法。本疫苗生产毒种为构建的JXA1‑RM株，不仅保持了JXA1‑R株安全性和免疫原性，且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高；疫苗免疫猪后，不产生针对美洲株PRRS病毒M蛋白线性表位肽氨基酸序列的多肽序列抗体，能用于区分免疫和自然感染动物；针对该毒株的鉴别诊断方法，可以诊断田间毒株和疫苗毒株产生的抗体，结合常规ELISA检测方法，能用于区分免疫该疫苗和自然感染田的动物，有利于高致病性猪蓝耳病的净化。

技术领域

本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其制备方法，并可通过血清学鉴别诊断方法实现免疫与自然感染的区分，属于兽用生物制品领域。

背景技术

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(俗称高致病性猪蓝耳病)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)变异株引起猪的一种急性、高度致死性接触性传染病。根据OIE制定的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》2008版本规定，该病被列为法定上报的动物疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，是威胁我国养猪业的重要传染病之一。

2006年高致病性猪蓝耳病暴发以来，研究人员通过不同方法研制出了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株JXA1-R、HuN4-F112株、TJM-F92株和GDr180株。这些毒株可以抵抗经典蓝耳病与高致病性蓝耳病强毒毒株攻击，在我国高致病性猪蓝耳病的防控中发挥了重要的作用，然而，近年来高致病性猪蓝耳病成散发趋势，依然导致巨大的经济损失，原有疫苗不能区分免疫和自然感染，目前仍在使用疫苗预防高致病性猪蓝耳病的国家或地区，想通过净化手段来达到控制消灭高致病性猪蓝耳病的目的，但是没有相应的方法能够区分免疫和自然感染，使得预防的效果一直不理想，现亟待开发一种能区分免疫和自然感染(DIVA，Discrimination of Infected from Vaccinated Animals)的疫苗。

申请人将临床分离毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1(保藏编号：CGMCCNo.1964)在MARC-145细胞系上进行人工连续培养，制备了对猪致病力显著下降的JXA-R株，并用该毒株研制了活疫苗(专利公开号：CN101307305)。本发明以高致病性猪繁殖与呼吸综合征JXA1-R株为基础，构建其全长感染性克隆，并突变JXA1-R毒株ORF6上的第159，160，164位的三个氨基酸，经拯救获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征标记疫苗毒株JXA1-RM，该毒株不仅同时保持了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫苗株JXA1-R安全性好，免疫原性优良等特点，而且ORF6上三个氨基酸的突变使JXA1-RM毒株免疫动物后与野毒株产生抗体差异，因此可以作为DIVA疫苗用于高致病性猪蓝耳病的预防与控制。

发明内容

本发明的目的主要是通过构建了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株的全长克隆，并通过反向遗传操作技术，突变该毒株ORF6上的第159位精氨酸(Arg)为赖氨基(Lys)，160位赖氨基酸(Lys)为精氨酸(Arg)，164位谷氨酰胺(Gln)为精氨酸(Arg)，成功拯救并繁殖了病毒，该病毒毒株命名为Porcine reproductive and respiratory syndromevirus JXA1-RM株。通过实验证实该标记疫苗毒株不仅对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染具有较好的免疫保护效果，而且不能诱导机体产生针对突变前该表位序列(SEQ IDNO.15)的特异性抗体，能通过针对该肽段(SEQ ID NO.15)的抗体来区分免疫与自然感染，从而在血清学上实现对标记疫苗的鉴别诊断。JXA1-RM毒株可作为能区分免疫和自然感染(DIVA)的疫苗毒株。本发明所建立的ELISA鉴别诊断方法，通过优化抗原包被条件和反应条件，能够通过血清学鉴别诊断免疫了JXA1-RM疫苗株的动物和自然感染动物。

本发明技术方案

本发明是通过以下技术方案来实现的：