[发明专利]一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法。

技术背景

卵母细胞是一类重要的生殖细胞，其良好的发育和成熟是雌性动物繁殖能力的重要指征。要想得到更多优质的卵母细胞，就要了解雌性动物卵母细胞发育过程的分子调控机理。纯度高、完整性好的卵母细胞总RNA是采用实时荧光定量RT-PCR技术或基于微量RNA的高通量测序技术分析卵母细胞的分子机理的非常重要的前提条件。RNA提取即将细胞破碎裂解，利用相关试剂去除多糖、酚类、蛋白质及DNA等的污染，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终获得纯净RNA。常用的提取总RNA的方法包括Trizol试剂快速提取法、RNAiso Plus试剂快速提取法、强变性剂法、热硼酸盐法及改良热硼酸盐法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法等。RNAiso Plus是广谱型总RNA提取试剂，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离，还能保证RNA的完整。RNAiso Plus试剂提取法也是一种较成熟的提取总RNA的方法，但该方法有一定局限性，特别是对于提取鱼类卵母细胞的总RNA样品时，存在提取步骤繁琐、样品转移损失严重直接导致提取浓度低、纯度差等问题。而且与体细胞相比，在卵母细胞发生过程中有大量的蛋白质、核糖体和其它细胞成分聚集以支持早期胚胎发育，这些物质也影响到提取的RNA质量。因此，需要建立一种快速简便、总RNA纯度高、杂质少、得率大，易于操作，便于掌握的微量鱼类卵母细胞总RNA提取的方法，以满足相应的分子生物学实验。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法，

以提高母细胞总RNA的提取效率和提取质量，同时增加获得母细胞总RNA的总量，以满足分子生物学试验的需要。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法，包括以下步骤：

1)鱼卵母细胞样品超声波破碎

取出-80℃保存卵母细胞，迅速放于用液氮预冷的无RNA酶EP管中，加入1mL RNAiso Plus，所述的EP管放置于冰水混合物中，提前将超声破碎头部分用焦碳酸二乙酯水溶液浸泡24h，然后高压灭菌，消除RNA酶污染，超声波处理器变幅杆浸入RNAiso Plus深度为0.8-1.2cm,依据实验样品发育阶段，进行超声波模式设定，超声处理后，将裂解匀浆液转移至无RNA酶EP管中，室温静置10min，以12000g转速4℃离心5min，吸取上清液，移入新的无RNA酶EP管中；

2)总RNA的提取

向上述裂解匀浆液中加入RNAiso Plus的1/5体积氯仿，样品剧烈振荡至溶液无分相现象后，再室温静置4-7min，以12000g转速4℃离心20min从离心机取出离心管，此时样品分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；取上清液转移至另一新的无RNA酶EP管中；加入等体积预冷的异丙醇，使用涡旋混匀器充分混匀，15-30℃静置，以12000g转速4℃离心15min，管底出现沉淀；

3)RNA沉淀清洗

小心弃去步骤2)最后一次离心的上清液，缓慢地沿管壁加入75％乙醇1ml洗涤沉淀，以12000g转速4℃离心5min，除去乙醇，得到RNA沉淀。

4)RNA溶解

室温干燥步骤3)得到的RNA沉淀，加入RNase-free水,60℃水浴5min后放置在碎冰上，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

本发明的原理是：

高丰度、高纯度、高完整性的卵母细胞RNA提取是在严格避免RNA酶污染情况下，利用化学法和超声波破碎物理学方法相结合获得卵母细胞中含有的总RNA，并保证RNA完整性，可以用于下一步基因克隆、mRNA表达和高通量测序等研究。本发明在微量卵母细胞(约30粒)中加入1ml RNAiso Plus，可有效去除卵母细胞中核糖体等成分；分别在加入氯仿和异丙醇后，离心时间均延长了5min，有利于去除蛋白质等，并提高所获的RNA纯度与质量。

本发明优点和积极效果如下：

1)本发明提取方法，可以提取不同种属、不同发育时相的鱼类卵母细胞中的总RNA,也可以提取不同发育时期受精卵的总RNA等，应用范围广泛。