[发明专利]拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物的检测，具体涉及一种拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法。

背景技术

拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)是导致食品腐败的一类重要微生物，在食品 和饮料行业中，尤其是葡萄酒和果汁，其原料和生产工艺注定了极大的污染概率。拜氏接合 酵母能够在弱酸性防腐剂如苯甲酸、山梨酸下生长(PittandHocking,1999)，而且由拜氏接合 酵母生长密度依赖很低，引起的食物腐败所需的细胞量很少，研究表明5个细胞就足以使得 碳酸饮料变质(PittandHocking,1999)。拜氏接合酵母广泛存在于自然环境中，原料葡萄以及 水、空气都可能会引进拜氏接合酵母。一些非酿造酵母与酿酒酵母之间复杂的相互作用为葡 萄酒的产生独特的风味，而拜氏接合酵母却因其会产生大量的异味物质如乙酸等,使得葡萄酒 感官变差，大量繁殖导致葡萄酒腐败变质。并且它们通常耐高温、高酒精、高酸、高糖和高 防腐剂，不易被清除。

由于每年在食品行业造成重大经济损失(ThomasandDavenport,1985),为保证商品的贮 藏周期和品质一贯性，同时作为产品生产品质控制的一种重要手段，葡萄酒和果汁中品质检 测项目中检测拜氏接合酵母项目尤其重要。

目前已经开发的检测拜氏接合酵母方法，采用选择培养基方法，依赖于拜氏接合酵母在 山梨酸酯或其他弱酸选择性培养基的生长能力，增殖时间通常需要4-5天，由于存在选择性 山梨酸酯等选择压力，受损的细胞可能不能被检测到。随着分子生物学技术的发展，国外有 学者有采用SYBRGreen荧光染料进行拜氏接合酵母检测，但荧光染料依靠双链DNA的结 合产生荧光信号，具有一定的假阳性概率，特异性不高。实时荧光PCR探针法凭借其不依赖 选择性培养，快速准确，特异性好，灵敏度高的优点，已经在很多微生物的检测分析中成功 应用。因此建立一种能够满足葡萄酒和果汁中拜氏接合酵母的实时荧光PCR探针法有很强的 实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拜氏接合酵母检测用引物和探针及其检测方法。

本发明首先涉及一种拜氏接合酵母检测用的引物组和探针序列：

上游引物序列为：5’-TTTGATCAGACATGGTGTTTTGC-3’；

下游引物序列为：5’-ATGCTGGCCCAGTGAACTG-3’；

探针序列为：5’-CCCCTCGCCTCTCGTGGGTG-3’，其5’端标记FAM报告荧光 基团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。

本发明还涉及一种应用所述拜氏接合酵母检测用引物和探针进行拜氏接合酵母检测的方 法，包括如下步骤：

(1)破碎样品细胞并提取DNA模板；

(2)使用所述引物进行实时荧光定量PCR检测，检测目标样品中是否含有拜氏接合酵 母。

其中，步骤(1)所述的破碎样本细胞并提取DNA的步骤为：

1)取1mL样品加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒 去上清液，加入1mL10mmol/LTris-HClpH8.0重悬沉淀，8000r/min的转速离心5min， 倒置于吸水纸上，吸干液体；

2)收集的菌体沉淀中加入600μL山梨醇buffer(配方为：每100mL中含有山梨醇22g； NaH₂PO₄0.27g；Na₂HPO₄1g；pH7.4，先配制成磷酸钠缓冲液再加入山梨醇)，加入50U 溶细胞酶(Lyticase)，涡旋振荡器上震荡充分混匀(30℃处理30min)；

3)4000r/min离心10min，弃上清，保留沉淀；

4)破壁后细胞沉淀加700μL20g/LCTAB裂解液，涡旋振荡器上震荡充分混匀，置于 65℃水浴中0.5～2h；

5)冷却至室温后，加入400μL酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，13000r/min 离心8min，转移上清至新离心管中，弃沉淀；如水相和有机相之间有白色沉淀物，则重新抽 提有机相，合并水相，将上清至新离心管中；

6)向上清液中加入1/10体积的3mol/LpH5.2的乙酸钠，用手指轻弹管壁，混匀；