[发明专利]一种酶及其应用

说明书

本发明公开了一种人工酶，该人工酶基于天然酶的序列改良制得，该天然酶具有催化如下所示的从化合物Ⅰ(尼古丁)转变成化合物Ⅱ(N‑甲基唛喔思明)的反应的活性，化合物Ⅱ(N‑甲基唛喔思明)可自发水合生成化合物III(假氧化尼古丁)，或者，该天然酶为尼古丁脱氢酶；上述改良包括将阻碍产物释放的氨基酸中的至少一个替换为侧链更小的氨基酸。该人工酶对底物的催化速率较天然酶提高，并且在制备治疗尼古丁成瘾的药物中非常有应用前景。

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种蛋白质突变体，尤其涉及一种尼古丁脱氢酶突变体，及其在开发治疗尼古丁成瘾方面蛋白质药物等方面的应用。

背景技术

尼古丁(Nicotine，1-甲基-2-[3-吡啶]-吡咯烷)是烟叶、卷烟烟气及烟草废弃物中的主要有害成分之一，不仅直接有害于健康，而且是烟草中主要致癌成分烟草特有亚硝胺(TSNA)的重要前体物。我国烟叶生产中每年都有大量的高尼古丁烟叶产生，不仅严重影响了烟叶的吸昧品质，而且增加了烟叶的有害性。降低烟草和环境中尼古丁的含量，对于维护人类的健康和保护生态环境有着极为重要的意义。

利用微生物降解尼古丁是降低烟叶和环境中尼古丁含量和有害性的一条新途径，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)和节杆菌属(Arthrobacter)能将尼古丁代谢分解以产生其生长所必需的碳源、氮源及能量。已发现的可代谢尼古丁的细菌有假单胞菌属(如Pseudomonas sp.No.41，P.convexa PC1，P.putida)、节杆菌属(如Arthobacter oxidansP-34，后来重新鉴定为A.ureafaciens；A.oxidans pAO1，后来重新鉴定为Arthrobacternicotinoborans)、纤维单胞菌属(Cellulomonas sp.)以及苍白杆菌属(Ochrobactrumintermedium)。真菌主要有刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、钝顶螺旋藻(S.platenses)和丝核薄膜革菌(Pelliculariafilamentosa)。

已经发现微生物代谢尼古丁主要通过3种途径：吡啶环途径(Pyridine pathway)，主要以节杆菌(Arthrobacter sp.)为主；吡咯环途径(Pyrrolidine pathway)，主要以假单胞菌属(Pseudomonas sp.)为主；去甲基化途径(Me pathway)，主要存在于真菌当中。在吡咯环途径中，尼古丁的吡咯环被氧化，生成甲基麦斯明烟草碱(methylmyosmine)，当加入水后，甲基麦斯明烟草碱开环形成假氧化型尼古丁，进而去甲基化，形成3-羧酸吡啶盐，吡啶环的6’位置再羟基化，形成6-羟,3-羧酸吡啶盐，脱去侧链形成2,5-二羟基-吡啶盐和琥珀酸盐。此代谢途径也可从6-羟-假氧化型尼古丁开始，最终仍生成2,5-二羟基-吡啶盐和琥珀酸盐。

尼古丁脱氢酶NicA2是最近从恶臭假单胞菌S16(Pseudomonas putida S16)分离出的能降解尼古丁的酶。有关尼古丁脱氢酶NicA2的报道可参见：PLoS Genet. 2013Oct；9(10):e1003923.doi:10.1371/journal.pgen.1003923.Epub 2013Oct 24.Systematicunraveling of the unsolved pathway of nicotine degradation inPseudomonas.Tang H,Wang L,Wang W,Yu H,Zhang K,Yao Y,Xu P。

尼古丁脱氢酶NicA2催化尼古丁降解第一步的脱氢反应，将尼古丁(I)转化为N-甲基唛喔思明(N-methymyosmine)(II)，N-甲基唛喔思明可进一步自发水合生成假氧化尼古丁(pseudooxynicotine)(III)。