[发明专利]一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因及其应用。本发明公开了具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因exiGS的序列和编码区，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码446个氨基酸。该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。生物学功能验证证明该基因具有高活性，耐低温，高温稳定性好，本发明初步验证了具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因的功能及其在抗草铵膦作物中的应用潜能。可广泛用于不同抗除草剂转基因植物的操作上。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因的分离鉴定。

背景技术

草铵膦(Glufosinate)是一种广泛使用的有机磷类除草剂，其有效成分是phosphinothricin(简称PPT)，L-PPT具有植物毒性，化学名称为(RS)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵，是外消旋体混合物，属灭生性仿生茎叶处理剂。草铵膦的研制与开发是与双丙氨膦密切相关。双丙氨膦是从链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中分离提纯的一种三肽天然产物，双丙氨膦本身无除草活性，在植物体内降解成具有除草活性的草铵膦。据此，德国艾格福公司直接合成草铵膦(Glufosinate)，成功开发出一个新除草剂品种。草铵膦制剂已被广泛使用在非耕地防除多种一年生和多年生禾本科草和阔叶草(AhrenW H et al 1994)。

由于草铵膦杀草谱广，在环境中迅速生物降解及对非靶生物低毒，因此如何将其作为作物田苗后选择性除草剂使用是十分必要的，而生物工程技术为此提供了可能。至今为止，在转基因抗除草剂作物研究与推广中，抗草铵膦作物仅次于抗草甘膦作物而居第2位，随着抗草铵膦作物种植面积的继续扩大，对抗草铵膦基因资源的需求也日益增大。然而如今对抗草铵膦作物的研究主要集中于发掘新的bar或pat抗除草剂基因，对草铵膦的靶标酶谷氨酰胺合成酶鲜有研究。

谷氨酰胺合成酶(GS，glutamine synthetase；EC 6.3.1.2)是生物体中最古老也是最广泛存在的酶(Kumada Y et al 1993),它参与许多生物体中的氮和碳代谢。且是生物体氮代谢的关键酶之一，而生物体维持生命必须要有氮代谢作用，因此该酶对生物体是至关重要的。GS基因在细菌、真菌、植物体中均被广泛研究(Streicher S L et al 1980,Sampio M J et al 1979,Stacey G et al 1979)。

对植物而言，谷氨酰胺合成酶是一个重要的解毒酶，可解除由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释放出的铵的毒性。在正常情况下，GS可以由ATP及glutamate形成λ-glutamyl phosphate。但在PPT处理后，PPT先与ATP结合，磷酸化的PPT占据GS分子的8个反应中心，使GS的空间构型发生变化，从而GS的活性受到抑制。PPT能抑制GS所有已知的形式，抑制的结果导致细胞内氨积累、氨基酸合成及光合作用受抑制、叶绿素破坏；但主要是通过对RuBp羧化酶/光呼吸作用迅速抑制造成引起植物死亡。除此之外，谷氨酰胺合成酶在植物体内具有多功能效应，向植物体内转入有效的外源GS基因或是超量表达GS酶，可以提高目标植物对草铵膦的抗性,同时也能增强植物抗土壤氮素贫瘠中、抗旱耐盐、抗强光照等特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有对高草铵膦耐受能力的谷氨酰胺合成酶及其编码基因，为进一步通过基因工程的方法，构建具有草铵膦抗性的转基因植物提供基因资源。