[发明专利]以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速繁殖方法

说明书

技术领域

本发明属于林木生物技术领域，具体涉及黑果枸杞组培快速繁殖和黑果枸杞玻璃化材料的去玻璃化。

背景技术

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属多年生多棘刺灌木。是重要的抗旱、抗盐碱沙漠先锋树种之一。黑果枸杞果实糖具有抗疲劳、防治糖尿病的功效。此外，黑果枸杞被称为原花青素之王。其原花青素具有清除自由基、增强免疫力、延长果蝇寿命、降低小鼠血清总胆固醇和甘油三脂、升高血清、肝组织和机体总抗氧化能力等功效。黑果枸杞集经济价值、生态价值、药用价值及保健价值于一身，其价格一直居高不下。近年来，农牧民疯狂采摘让一些野生黑果枸杞植株不再挂果。如何保护并充分合理的开发利用黑果枸杞资源，是非常值得关注的重要课题。目前黑果枸杞苗木市场仍以种苗为主。种苗价格较高，并且很难完全保持亲本的优良性状。植物组织培养最可能成为快速提供优质低价苗木的有效方法，我们前期的研究已经建立了以黑果枸杞叶片和茎段为外植体的高效再生体系（图1）。该体系为黑果枸杞快速育苗、种质保存、叶片脱分化以及愈伤再分化研究、叶腋分生组织和包埋茎形成层分化研究、叶盘转化、分子育种、体细胞无性系变异育种研究等提供了不可或缺的基础。但是随着离体培养时间的延长，黑果枸杞体细胞胚、丛生芽或不定芽存在一定比例的玻璃化。玻璃化严重降低了黑果枸杞的有效增值系数，造成人力、财力和实验材料等的浪费。

所谓玻璃化是植物组织培养过程中经常发生的一种生理失调现象，玻璃化苗通常生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸状。玻璃化苗的生根能力大大减弱，难以移栽成活，严重影响离体快速繁殖效率。玻璃化与污染、褐化并称为植物组织培养过程中的三大难题，引起人们的极大关注。针对黑果枸杞以外的其它植物种，人们尝试过多种预防组培玻璃化的方法。但是几乎没有能够完全抑制玻璃化产生的方法。对于快速繁殖的黑果枸杞组培材料，玻璃化很难防患于未然。因此，玻璃化组培材料的去玻璃化非常必要。尤其对于一些珍贵稀缺的黑果枸杞组培材料，去玻璃化显得尤为重要。截止到目前，未检索到任何预防或者解除黑果枸杞组培材料玻璃化的方法报道。

发明内容

为解决黑果枸杞野生资源稀缺、种苗价格高昂的问题，本发明提供一种高效快速的黑果枸杞无性繁殖方式。此外，为解决组培材料玻璃化的问题，本发明提供一种去除黑果枸杞组培材料玻璃化的简单方法。

以下为本发明采用的技术方案：

1.无菌种苗的获得

将黑果枸杞成熟种子置于35～37℃温水中处理7～24h或者不处理。在无菌超净工作台用70-75%(体积/体积)酒精浸泡种子30S～1min，再用0.1～0.2%（质量/体积）的氯化汞水溶液或者2%（质量/体积）次氯酸钠溶液浸泡2～5分钟，无菌水冲洗3～6遍。将种子接种到不添加任何植物生长调节剂的1/2MS或MS固体培养基上，20～28℃每天8～16小时光照培养。此步和以下各步用到的MS固体培养基均添加0.43～0.7%（质量/体积）的固化剂琼脂，3～4%（质量/体积）的蔗糖。121℃高压灭菌15～20min之前用NaOH或KOH溶液将pH值调节到5.4～5.8。1/2MS固体培养基添加蔗糖浓度为MS固体培养基的一半。

2.外植体接种

待步骤1萌发的种苗长到叶片数为10～20时，将生长良好的幼叶片横向剪或切为直径3～5mm的小块（单片叶剪为2～3块），接种到含6-BA 0.05～1.0 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下置于微弱散射光下培养1～4周。之后转到正常光照下培养，每天光照8～12 h。将有叶或去叶的茎剪切为0.5～2 cm的小段，下端朝下插入含6-BA 0.05～1.0 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下每天光照8～12 h。也可用叶片或茎外植体产生的无菌完整植株或无菌无根植株的幼嫩叶片和茎段做为外植体。

3.继代增殖

外植体接种4周左右进行继代，将培养材料转接到相同的培养基上。叶外植体产生的高度达到1cm以上的芽可切下诱导生根。有节茎段产生的高度2 cm以上的芽可切下诱导生根。切完之后的材料继代到相同培养基置于相同的培养条件下继续增殖。继代间隔时间为4周左右。

4.干燥饥饿法去除玻璃化