[发明专利]一种利用甘蓝游离小孢子筛选抗黑腐病突变体植株的方法

权利要求书

1.一种利用甘蓝游离小孢子筛选抗黑腐病突变体植株的方法，其特征在于，包括下列 步骤：

1）黑腐病病原菌分离纯化步骤；

2）黑腐病病原菌粗毒素提取步骤；

3）小孢子游离与纯化步骤；

4）诱导抗病突变胚状体步骤；

5）胚状体分化抗病突变体不定芽步骤；

6）不定芽生根培养步骤。

2.根据权利要求1所述的利用甘蓝游离小孢子筛选抗黑腐病突变体植株的方法，其特 征在于，所述的黑腐病病原菌分离纯化步骤是在甘蓝种植田采集感病叶片，取回后在室内 流水冲洗0.5h后，放在培养皿中备用，用70%的酒精喷施叶片表面，在无菌超净工作台 上0.1%的升汞浸泡5min，随后用无菌水冲洗3次，取病健交界组织约1cm见方的小块，放 入研钵中加无菌水研磨，在pH值为7.2，NaCl含量为5g/L的牛肉膏蛋白胨培养基上，将病菌 分离成单个的菌落，连续平板划线法分离，获得纯合菌。

3.根据权利要求1所述的利用甘蓝游离小孢子筛选抗黑腐病突变体植株的方法，其特 征在于，所述的黑腐病病原菌粗毒素提取步骤是将黑腐病病原菌接种于牛肉膏蛋白胨平板 培养基上，28℃培养48h，取一环菌种放入盛有50ml牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中， 放置培养箱28℃下过夜培养；随后将三角瓶置于摇床中70r／min、30℃下振荡培养5d，纱网 过滤，8000r/min，30min离心，上清液经0.45um微孔滤膜抽滤，获得粗毒素，无菌操作下上 清液经0.22um微孔滤膜抽滤，获得无菌粗毒素。

4.根据权利要求1所述的利用甘蓝游离小孢子筛选抗黑腐病突变体植株的方法，其特 征在于，所述的小孢子游离与纯化包括下列步骤：

1）将已消毒的甘蓝花蕾放入无菌试管中，以含蔗糖140g/L的B5培养基为洗涤剂，用玻 璃棒挤压花蕾使小孢子游离出来；

2）用孔径50μm无菌网过滤，收集滤液于离心管中，离心3次，沉在离心管底部的即为纯 净小孢子；

3）将小孢子沉淀物均匀悬浮于秋碱浓度为10～20mg/L的NLN-14培养基10ml中，吸 取少量悬浮液用血球计数板计数，将小孢子密度调整为1×10⁵～2×10⁵个/ml；

4）将小孢子悬浮液移入培养皿中，每皿2ml，再添加NLN-14培养基3ml，共计5ml。

5.根据权利要求1所述的利用甘蓝游离小孢子筛选抗黑腐病突变体植株的方法，其特 征在于，所述的诱导抗病突变胚状体包括下列步骤：

1）吸取0.05～0.5ml黑腐病粗毒素母液直接添加于含有5mlNLN-14悬浮小孢子的培养 皿中，使粗毒素体积浓度在10～90ml/L之间，封口；

2）将培养皿静置在32℃下黑暗培养48h；

3）将培养皿内含小孢子的培养基装入离心管置于离心机中，在2000r/min的速度下离 心三次，第一次离心10min，弃去上清液；第二次再向离心管内加入10mlNLN-14悬浮液培 养基，继续离心10min，弃去上清液；第三次再向离心管内加入10mlNLN-14悬浮液培养基， 继续离心5min，弃去上清液；然后将小孢子悬浮培养在新鲜6mLNLN-14培养基中，培养于 培养皿中，封口；

4）将悬浮小孢子的培养皿静置于25℃、黑暗条件下继续培养，直到肉眼可见小白点 时，改换为振荡培养；

5）将肉眼可见小白点的培养皿转至60r/min振荡培养，同时保持适当的弱光条件，继 续培养直至胚状体发育完全。