[发明专利]一种亲水相互作用色谱固定相及其制备方法

说明书

技术领域

本发明是涉及一种亲水相互作用色谱固定相及其制备方法，属于色谱分析技术领域。

背景技术

亲水相互作用色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography,HILIC)作为一种高效液相色谱技术，在强极性和离子型化合物如氨基酸、碳水化合物和多肽等的分离分析中发挥着重要作用。近年来，随着蛋白组学、糖组学、代谢组学等生命科学领域对极性化合物分离需求的增加，亲水相互作用色谱得到了快速发展。

作为色谱技术的核心，固定相材料的发展直接影响着色谱分离的选择性和分离效率，制约着亲水相互作用色谱的应用和推广。HILIC固定相种类繁多，早期HILIC的固定相主要是NPLC(Normal Phase Liquid Chromatography，正相色谱)的固定相，如纯硅胶、氨基键合相、氰基键合相、二醇基键合相。但是，这些固定相均存在一定的缺陷，例如：纯硅胶柱在中性或碱性条件下，由于没有任何键合相的保护，硅胶颗粒容易溶解，稳定性较差，亲水性不强，对极性化合物的保留较弱，且分离选择性相对不足；氨基键合相与酸性化合物结合能力强，对一些强酸性化合物容易产生死吸附，在分离一些还原糖时，氨基容易与醛基形成席夫碱，改变键合相和分析物的性质，并且氨基柱稳定性较差，键合相容易流失；氰基键合相极性弱，对亲水性化合物的保留差，二醇基键合相为非离子型键合相，具有一定的氢键作用，其表面极性大于氰基键合相，然而相比于硅胶柱其亲水性较差，因此，氰基和二醇基键合相的应用领域较少。

随着研究的深入，目前通常采用的HILIC固定相主要以硅胶基质为基础，采用降低表面硅羟基密度或共价连接极性配基的方式合成，例如：将含酰胺基、羟基、两性离子等强极性基团的分子键合到基质表面。采用的基质通常为硅胶基质，少部分为聚合物基质。这些固定相较以往的固定相而言，其分离效率和分离选择性有所提高，但是仍然存在一定的缺陷，例如：流动相中需要添加缓冲盐，操作较为繁琐，成本较高；分离过程液相的流速范围为毫升至微升，导致进样量多，样品浓度高，灵敏度低，从而导致分析效果较差等。

N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)是水溶性非离子型高分子化合物聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)的前体。聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)是一种具有溶解性、低毒性、生物相容性、成膜性、化学稳定性、生理惰性等优异性能的均聚物，广泛应用于医疗卫生、日用化工、食品、饮 料、酿造、纺织印染、新材料等领域，但目前还没有关于聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)用于制备亲水相互作用色谱固定相的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种亲水相互作用色谱固定相及其制备方法。

本发明所述的亲水相互作用色谱固定相，是指在多孔硅胶表面键合有聚乙烯基吡咯烷酮的硅胶整体柱或在毛细管内壁直接键合有聚乙烯基吡咯烷酮的毛细管整体柱。

作为优选方案，所述硅胶整体柱的制备包括如下步骤：

a)无机硅胶整体柱的制作：先将聚乙二醇、尿素用醋酸溶解，使形成均相透明溶液，然后加入四甲氧基硅烷，搅拌使四甲氧基硅烷完全水解得到聚合液，再在氮气保护下将聚合液灌入毛细管柱中，两端封口后在35～45℃陈化反应15～25小时，得到无机硅胶整体柱；

b)无机硅胶整体柱的中孔制备：对步骤a)制得的无机硅胶整体柱采用程序升温方式升温至120℃进行热处理以制备中孔，得到具有双孔结构的无机硅胶整体柱；

c)无机硅胶整体柱的老化：分别用水和甲醇依次冲洗步骤b)制得的具有双孔结构的无机硅胶整体柱，接着室温干燥直至甲醇全部挥发，再采用程序升温方式升温至320℃进行老化处理；

d)无机硅胶整体柱的活化：先采用4～8M的浓盐酸活化5～7小时，随后用水冲洗至中性，接着用甲醇冲洗、氮气干燥，再在175～185℃加热0.5～1.5小时；

e)硅烷化修饰：先将γ-甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷(简称γ-MAPS)的甲醇溶液灌入经步骤d)活化处理后的无机硅胶整体柱中，再在55～65℃反应10～14小时，接着用甲醇冲洗、氮气干燥，得到硅烷化修饰的硅胶整体柱；

f)N-乙烯基吡咯烷酮修饰：先将N-乙烯基吡咯烷酮和偶氮二异丁腈用甲醇和二甲苯的混合溶剂超声溶解，然后将混合溶液灌入到硅烷化修饰的硅胶整体柱中，再在75～85℃反应10～14小时，接着用甲醇溶剂冲洗，用流动相平衡后备用。