[发明专利]基于LAMP技术检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于LAMP技术检测李痘病毒的引物、试剂盒及 检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

李痘病毒Plumpoxvirus,PPV是核果类果树危险性最大的病毒 之一，果树一旦受其侵染，则会造成未成熟果实大量脱落，使产量严 重降低，并且使果实品质大幅度下降，而且该病毒传播速度快，在短 时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难性损失。该病毒1915 年在保加利亚首次被发现，而后迅速传遍欧洲大多数国家以及地中 海、中非、印度和智利，目前美国和加拿大也有其发生的报道。由于 该病毒危害性及其严重，因此它已被欧洲植保组织列入了A2类检疫 性病原物，其它国家也对其表现出极高度的重视，纷纷加大对其研究 的力度并制定了一系列严格的检测和根除措施，防范于未然。目前中 国暂未有发现有关该病毒的正式报道，由于目前我国同其他国家种质 资源交流越来越频繁，为了防止该病毒随着苗木等繁殖材料的引进而 进入我国，以保护我国农业的健康和可持续发展，必须加强对该病毒 的检验检疫。

目前，我国出入境植物病毒检测所采用的主要技术方法是酶联免 疫吸附ELISA检测和反转录聚合酶链式反应RT-PCR检测。传统的 ELISA技术在实际应用过程中存在检测灵敏度低，检测耗时长，容易 出现假阳性结果；RT-PCR技术虽然灵敏度高，但是存在RNA抽提繁 琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖物质的干扰，难 以实现植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。因此，建立新的 快速、简捷、灵敏的检验检疫技术手段已经迫在眉睫。

植物病毒病的诊断和病原鉴定，是认识病毒病害、防治病毒病的 基础，也是植物病毒分类学研究的一个重要内容，植物病毒检测的基 本内容包括病毒的生物学特性、形态学特征、理化特性、基因组结构、 抗原特性等几个方面，涉及到生物学测定、血清学测定、生理生化测 定、电镜技术、分子生物学技术等多种手段。目前，我国出入境植物 检疫所采用的检测技术的主要手段主要是：口岸现场检疫、生长季隔 离检疫、指示植物检验、血清学检验、分子生物学检验。这些手段存 在的主要问题为：1：检测周期长，不符合国务院提出的“加快通关 速度”的精神；2：容易出现假阳性反应；3：检测方法繁琐复杂，不 利于基层单位实际应用；4：主要检测试剂或产品来源于国外公司， 不仅购买价格高，而且定购时间长，这些都不能适应我国经济快速发 展的需要。因此，建立新的快速有效的检验检疫技术手段已经迫在眉 睫。

目前对病毒的主要技术检测方法是酶联免疫吸附ELISA检测和 反转录聚合酶链式反应RT-PCR检测。ELISA可以定性、定量测定样 品中的病毒，是实现目前鉴定病毒的最好手段之一。但是，血清学反 应的必须具备高效的抗血清，另外血清学检测对一些病毒含量低和含 有干扰测定物质的样品则不能做出准确的测定，容易出现假阳性的结 果，并且存在检测时间长的问题，不能满足目前口岸快速检测的要求； RT-PCR技术是应用最广泛的分子生物学新技术之一，利用RT-PCR技 术对病毒的检测相比ELISA检测具有灵敏度高的特点，可检测的最低 病毒含量达到fg水平。目前在RT-PCR技术基础上不断衍生出许多新 的技术，例如实时荧光RT-PCR技术，基因芯片技术等，使其应用范 围不断扩大，特异性和敏感性也不断提高，但是这些分子生物学技术 存在RNA抽提繁琐并且容易降解，PCR反应容易受寄主中多酚、多糖 物质的干扰，限制了植物病毒病害样品的快速、简便、高效检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快 速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，基于LAMP技术 检测李痘病毒的引物；

本发明另一个目的是提供一种包含上述引物的用于检测李痘病 毒的试剂盒；

本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测李痘病毒的 方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种基于LAMP技术检测李痘病毒的引物，其特征在于包括：

正向外引物F3：5'-CCTTTGATTTCTACGAGATGAC-3'；

反向外引物B3：5'-ACCACTACACTCCCCTC-3'；

正向内引物FIP：

5'-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAAGTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3'；