[发明专利]非对称二甲基精氨酸免疫原、抗体和检测试剂及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及非对称二甲基精氨酸免疫原、抗非对称二甲基精氨酸特异性抗体和非对称二甲基精氨酸检测试剂及其制备方法。

背景技术

非对称二甲基精氨酸(Asymmetricdimethylarginine，ADMA)，其结构式如式（Ⅱ）所示：

式（Ⅱ）

非对称二甲基精氨酸是一种可在人血清、血浆及尿液中检测到的内源性分子，它是一种甲基化的精氨酸，由组成细胞内蛋白质的精氨酸残基在蛋白精氨酸甲基转移酶催化下发生甲基化，再经水解反应生成。现已证明，体内存在ADMA调节一氧化氮（NO）生成的内源性机制，即ADMA能竞争性抑制一氧化氮合成酶（NOS）的活性，从而减少血管内皮细胞一氧化氮的合成。ADMA广泛存在于组织和细胞中，正常人体内每天产生约300μmol（约60mg），体内浓度远远高于其他同样可产生NOS抑制作用的内源性精氨酸，故被认为是最重要的NOS抑制剂。ADMA从细胞进入血液循环后，一小部分被直接分解通过肾脏随尿液排出，但大部分通过广泛分布于肾脏、肝脏和心血管系统的二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）催化降解。国内外大量临床研究证明：ADMA含量异常会造成血管内皮功能紊乱并导致多种心血管疾病的发生，如动脉粥样硬化、冠心病、高脂血症、脑梗死、高血压、心力衰竭和中风等。因此，ADMA已被公认为是一种新的心血管疾病重要标志物。目前有研究指出：ADMA浓度升高不仅与心血管功能异常有关，而且还与慢性肾功能衰竭、糖尿病、先兆子痫、高同型半胱氨酸血症、肝脏衰竭、勃起功能障碍等疾病的发生发展密切相关。

鉴于此，建立适用于临床的ADMA检测方法具有重大意义，但是血液中ADMA浓度水平较低，且存在精氨酸和对称性二甲基精氨酸（SDMA）对ADMA检测的交叉反应干扰，因此ADMA检测难度较大。目前，测定ADMA的方法主要包括：高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法以及酶联免疫法等。高效液相色谱及高效液相色谱-质谱联用方法的共同特点是精确性好、特异性高，缺点是操作复杂、样品处理繁琐、试验耗时长、需要特殊昂贵仪器，无法进行高通量分析，难以应用于临床。酶联免疫法相对色谱法略微方便，其缺点在于需手工操作，耗时长，受人为因素影响大，难以实现自动化，目前主要应用于实验研究。此外，文献还报道了用于ADMA测定的荧光偏振免疫测定法、放射免疫测定法、胶乳增强免疫比浊法、克隆酶供体免疫测定法、酶法等可能的检测方法，但是目前市场上还没有大规模临床应用的成熟产品。因此，研发一种能方便、快速、准确地测定人体样本中ADMA含量，灵敏度和特异性达到临床要求，同时能够应用于全自动生化仪的方法和试剂盒已成为临床检验领域的迫切需求。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用独特的非对称二甲基精氨酸制备免疫原性强的非对称二甲基精氨酸免疫原及其抗体，用该抗体制备的非对称二甲基精氨酸均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对非对称二甲基精氨酸高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低非对称二甲基精氨酸检测成本，有利于临床推广使用。

本发明的一个目的在于提供一种免疫原性强的非对称二甲基精氨酸免疫原。

本发明的另一个目的在于提供一种非对称二甲基精氨酸免疫原的制备方法。

本发明的又一个目的在于提供使用本发明非对称二甲基精氨酸免疫原制备得到的特异性强的抗非对称二甲基精氨酸特异性抗体。

本发明的再一个目的在于提供一种非对称二甲基精氨酸检测试剂及其制备方法。

本发明的非对称二甲基精氨酸免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗非对称二甲基精氨酸特异性抗体。该抗体特异性高，与非对称二甲基精氨酸的结合力强。由该抗体制备得到的非对称二甲基精氨酸检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的非对称二甲基精氨酸含量。本发明是通过以下技术方案实现的：

一种非对称二甲基精氨酸免疫原，其结构式如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）

载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种。更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。

所述的非对称二甲基精氨酸免疫原由非对称二甲基精氨酸与上述载体连接而成，非对称二甲基精氨酸的化学结构如式（Ⅱ）所示：

式（Ⅱ）

该非对称二甲基精氨酸免疫原的制备方法如下：