[发明专利]蓝色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示踪基因纳米载体的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种可实时跟踪外源基因的纳米载体的制备方法及其应用，属生物技术 和医药技术领域。

背景技术

基因转染是一种非常常规的生物和医药技术，但是通常的基因转染用的试剂是相对 分子质量为25,000的聚醚酰亚胺(PEI)，虽然该PEI比相对分子质量为600的PEI的 转染效率高，但是其细胞毒性也比相对分子质量为600的PEI大得多，因此将相对分子 质量为600的PEI连接至一纳米微球上便可以成功制备出一种转染效率高，细胞毒性低 的新型基因转染载体。

此外，用常规的基因转染试剂进行转染细胞时，很难方便的示踪基因载体的具 体位置，也就无法判定目标细胞是否有外源基因的的进入。于是可以通过先合成一 种含有介孔的纳米基因载体，然后装载有机染料(如可以对细胞核进行着色的DAPI 染料)来对细胞核进行着色，以达到示踪基因载体和对靶向细胞着色的目的，并评 估目的基因是否进入了靶向细胞。因此，研制出一种具有转染效率高，细胞毒性小， 并且可以实时跟踪外源基因的纳米载体等优势的新型基因载体具有重大的意义，在生 物技术和医药技术领域具有重要的科研和临床应用前景。

发明内容

根据现有技术的不足，我们提出具有转染效率高，细胞毒性小，并且可以实时 跟踪外源基因的纳米载体等优势的新型基因载体的制备方法。

本发明的技术方案包括：介孔硅壳纳米颗粒表面连接分子量大小为600的低分子量 聚醚酰亚胺(PEI)。蓝色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料染料的包埋:将DAPI染料包埋 至介孔二氧化硅纳米的介孔中。

本发明的优势：1)具有较高的基因转染效率。2)具有较低的细胞毒性。3)可以通 过观察纳米载体内DAPI染料的分布情况来实时跟踪基因所到达的位置。

具体技术方案如下：

一种蓝色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示踪基因纳米载体的制备方法；其特征是 步骤如下：

1)称取介孔二氧化硅纳米颗粒用无水吡啶配制成1～100毫克每毫升的溶液，加入 质量比为1:3～1:30的丁二酸酐，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6～12小时，得到羧基 化的介孔二氧化硅纳米颗粒；

2)将羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒溶解于去离子水中；加入质量比为1:1～1:10、 相对分子质量为600的聚醚酰亚胺，并在磁力搅拌条件下，搅拌反应6～12小时；待反 应结束后，用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到可吸附DNA的基因纳米载体；

3)将基因纳米载体配成1～10毫克每毫升的水溶液，然后加入与基因纳米载体的 质量比为1:2～1:20的蓝色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料，在磁力搅拌条件下，搅拌 反应6～12小时；待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀1～3遍，得到实时跟踪外源基 因的介孔二氧化硅基因纳米载体。

制备的蓝色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示踪基因纳米载体，直径为80～150纳 米，孔径为0.5～2纳米，载药率为20～40％。

本发明的方法制备的蓝色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料示踪基因纳米载体，其基 因转染效率为40～70％，细胞存活率为80％～95％。

本发明可通过观察纳米载体内蓝色4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染料的分布情况来实 时跟踪基因所到达的位置。

具体说明如下：

介孔二氧化硅基因纳米载体的步骤如下：

1)介孔二氧化硅纳米颗粒的羧基化：取一干净的小玻璃瓶，向其中量取浓度为5～ 10毫克/毫升，直径为80～150纳米，孔径为0.5～2纳米的介孔二氧化硅纳米颗粒。然 后加入10～100毫克的丁二酸酐，以50～100W的功率超声溶解丁二酸酐，最后于100～ 500转/分钟，15～50℃条件下搅拌反应6～12小时。待反应结束后，以9,000～11,000 转/分钟，离心5～20分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍。

2)介孔硅壳纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI)：将步骤1)中羧基化的介孔二氧 化硅纳米颗粒溶解至2～5毫升的去离子水中并转移至一10毫升的玻璃瓶中，然后加入 30～200微升，相对分子质量为600的聚醚酰亚胺(PEI)，并于100～500转/分钟，，15～ 50℃条件下搅拌反应6～12小时。待反应结束后，以9,000～11,000转/分钟，离心5～ 20分钟，并用去离子水洗涤沉淀1～3遍，即得到可以吸附DNA的基因纳米载体。