[发明专利]一种检测猪衣原体病的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测猪衣原体病的引物、试剂盒及方法。

背景技术

衣原体是介于细菌和病毒之间的一类微生物,直径0.2μm～1.5μm,它只能在寄主细胞原生质内部以一种发育史进行繁殖。此发育史是以小的原体变成较大的网状体为特征的,网状体以分裂方式繁殖,网状体发育成熟后破裂,释放出大量的原体。原体具有感染性,网状体对新的宿主细胞未见感染性。鹦鹉热衣原体革兰氏染色呈阴性。细胞壁的结构和成分与其他革兰氏阴性菌相似,但只有微量或无胞壁酸。

猪衣原体病主要是由鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)感染猪引起的一种多征候性传染病,临床表现为怀孕母猪流产、早产和产出生命力弱的仔猪；仔猪肺炎、肠炎、心包炎、脑膜脑炎、多关节炎和结膜炎；公猪睾丸炎等症状。其中猪衣原体性流产和引起仔猪大批死亡的衣原体性肺炎-肠炎对集约化养猪业危害严重。

目前对猪衣原体病的诊断方法主要有吉姆萨染色镜检以及鸡胚卵黄囊接种进行病原分离等方法。吉姆萨染色镜检方法受主观影响大，结果偏差大。而病原分离耗时耗力，分离率低。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种猪衣原体病的检测方法，以及该检测方法所使用的引物，该引物可特异性扩增鹦鹉热衣原体，快速对临床样品进行检测。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测猪衣原体病的引物，所述引物如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示。

上述引物在制备检测猪衣原体病的试剂盒中的应用。

一种检测猪衣原体病的试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测猪衣原体病的引物。

一种检测猪衣原体病的方法，采用上述引物，包括以下步骤：

以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定；所述PCR扩增反应的反应体系为：

所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min进行预变性；然后94℃30s，52℃30s，72℃50s，共进行35次循环；最后72℃延伸10min。

与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：

1、本发明的检测猪衣原体病的引物可以特异性地扩增猪鹦鹉热衣原体，对其他常见病原如猪弓形虫、猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等无反应；

2、本发明的检测猪衣原体病的方法具有很高的灵敏性，灵敏度可达25ng左右，可以方便、快捷的对各种临床猪样品的猪鹦鹉热衣原体进行检测，有利于快速制定针对性的防控措施，操作简单、实用。

附图说明

图1为本发明实施例1中猪衣原体病临床样品检测图谱，其中泳道1为猪鹦鹉热衣原体阳性对照，泳道2为猪鹦鹉热衣原体阴性对照，泳道3、4、5、6为临床样品；

图2为本发明试验例1中猪鹦鹉热衣原体的PCR检测方法的特异性的电泳图谱，其中：泳道1为猪鹦鹉热衣原体阳性样品，泳道2为猪鹦鹉热衣原体阴性样品，泳道3-8分别为猪弓形虫、猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌样品；

图3为本发明试验例2中猪衣原体病的PCR检测方法的灵敏度的电泳图谱，其中泳道1、2、3、4、5、6、7的DNA浓度分别为2.48μg、0.248μg、24.8ng、2.48ng、0.248ng、0.0248ng、2.48pg。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1检测猪衣原体病的引物和方法

1、引物设计

根据NCBI登录的猪鹦鹉热衣原体MOMP(majoroutermembraneprotein)基因序列(登录号：AB468956，KM609426，CP003790，EU856033，CP002807，CP002805，CP002586，FQ482149)进行比对，并设计了猪鹦鹉热衣原体PCR引物，分别为F1、R1。

F1:TCCTTACAAGCCTTGCCTGTAGG(SEQIDNO:1)

R1:AGCGTATTGGAAYTCRGCTC(SEQIDNO:2)

其中，兼并碱基代码：Y＝C/T，R＝A/G