[发明专利]用三重复合免疫捕获RT-PCR同步检测百合三种病毒的方法

权利要求书

1.一种用三重复合免疫捕获RT-PCR同步检测百合隐症病毒LSV、斑驳病毒LMoV和黄瓜花叶病毒CMV的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①引物设计

根据LSV、LMoV和CMV的CP基因序列, 设计LSV、LMoV和CMV的特异性正向和反向引物，扩增LSV、LMoV和CMV目的片段的大小分别为198bp、395bp和248bp；其中LSV、LMoV和CMV的特异性正向和反向引物序列为：

LSV-F: 5’- TATGGGCTTCCA ATACAAC-3’

LSV-R: 5’-TATTCGGTTTCCAGGTTC -3’

LMoV-F : 5’- TGGCACCTCACCAAATGTA-3’

LMoV-R: 5’- CATCATCTGCTGTATGCCTCT-3’

CMV-F: 5’- CTTTGTAGGGAGTGAACGCTGTA -3’

CMV-R: 5’-AGATGGCGGCAACGGATA -3’；

②三重复合免疫捕获

1）取100mg复合感染LSV+LMoV+CMV的组织，加1mL PBST研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；

2）用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV、LSV和CMV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV、LSV和CMV三种抗体的终浓度分别为1μg/mL、10μg/mL和50μg/mL，取200μL上述稀释的混合抗体加入PCR管，37℃孵育2h；

3）弃去步骤2）中三种抗体的包被混合液，用PBST洗3次，每次3min; 加入200μL感病组织粗提液，37℃孵育3h；

4）弃去步骤3）中的感病组织粗提液，用PBST洗3次，ddH₂O洗1次，短暂离心，吸去残液；

③三重RT-PCR

1) 在包被过的PCR管中分别加入10 μmol/L的LSV、LMoV和CMV特异性反向引物LSV-R、LMoV-R和CMV-R各2μL以及ddH₂O 6μL，混合后于70℃保温10min，之后迅速冰浴2 min；

2）三重RT：向上述PCR管中分别加入5×M-MLV buffer 4μL、10mmol/L 的dNTP混合物2μL、30U/μL的RNase抑制剂0.68μL、200U /μL 的M-MLV反转录酶0.70μL以及DEPC-H₂O 0.62μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到三种病毒的cDNAs混合物；

3）三重PCR： 取一新的PCR管，分别加入上述步骤2）中三种病毒的cDNAs混合物2.0μL、10×PCR buffer 2.5μL、25 mmol/L 的MgCl₂ 2.5μL、2.5mmol/L 的dNTP混合物2.5μL、10μmol/L 的LSV特异性正向和反向引物LSV-F 和LSV-R 各0.5μL、10μmol/L 的LMoV特异性正向和反向引物LMoV-F 和LMoV-R 各0.5μL、10μmol/L 的CMV特异性正向和反向引物CMV-F和CMV-R 各0.5μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶 0.3μL以及ddH₂O 12.2μL，混合均匀后进行三重PCR；上述三重PCR的反应条件为: 94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃～58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30～35个循环，最后72℃延伸7min，降至常温；

④电泳检测

三重PCR反应结束后取10μL反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在1×TBE缓冲液环境中，100V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，LSV、LMoV和CMV三种病毒核酸片段的电泳条带分别出现在198bp、395bp和248bp处；

⑤结果分析

根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV、LMoV或CMV，若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV；若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV；若凝胶中仅存在248bp的核酸片段则说明样品中含有CMV；若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV；若凝胶中同时存在198bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和CMV；若凝胶中同时存在198bp、395bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV、LMoV和CMV。