[发明专利]小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法及其应用

说明书

技术领域

本发明专利属于动物病原微生物检测技术领域，具体的说是一种同时鉴别小反刍 兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒的多重RT-PCR检测方法。

背景技术

近年来，农业部及各省市农业部门出台了一系列促进草食畜牧业发展的文件和措 施，牛羊产业得到前所未有的发展良机。然而，一些牛羊外来病、新发传染病(如小反刍兽疫 病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒)常引起牛羊大量发病、死亡，养殖场损失严重。

小反刍兽疫(Pestedespetitsruminants，PPR)，又名小反刍兽假性牛瘟 (pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoenteritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitis- pneumoenteritiscomplex)，是由小反刍兽疫病毒(Pestedespetitsruminantsvirus， PPRV)引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，包括绵羊、山羊、水牛、岩羊、盘 羊等，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征，病死率高。非洲、亚洲、欧洲等国家流行广泛，影响严 重。

施马伦贝格病(Schmallenbergdisease，SBD)，由施马伦贝格病毒 (Schmallenbergvirus，SBV)感染引起，临床症状为发热、腹泻、乏力等，以及奶牛产奶量降 低，新生幼畜出现缺陷等。目前，该病席卷整个欧洲，部分非洲和亚洲国家也被波及。

库布病毒(Kobuvirus，KBV)是小核糖核酸病毒科库布病毒属成员，为无囊膜RNA病 毒，库布病毒属至少分为4个种：人库布病毒(也称Aichi病毒)、牛库布病毒、羊库布病毒及 猪库布病毒。目前，库布病毒引起的临床症状主要为腹泻。呈世界流行。

当前，牛羊等养殖场中病原混合感染严重。且现有的检测方法检测病原单一，存在 着费时费力、不能同时鉴别小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒等三种病毒的缺 点。

发明内容

本专利的目的在于运用分子生物学、生物信息学等方法进行引物设计、序列比对 及反应体系优化，构建小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒分子鉴别诊断方法，实 现小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒“一样三检”的快速检测效果。该方法为小 反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒诊断提供一种快速检测方法，填补三种病毒不 能同时诊断的空白，为牛羊疫病的诊断、调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。

本发明专利要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

本发明涉及的检测引物有3对，分别是PPRV引物对、SBV引物对及KBV引物对，其中 用于PPRV检测的PPRV引物对包括PPRV-F和PPRV-R两条引物，用于SBV检测的SBV引物对包括 SBV-F和SBV-R两条引物以及用于KBV检测的KBV引物对包括KBV-F和KBV-R两条引物。

本发明的特征还涉及到以下步骤。

配置50μLPCR反应体系：2×Buffer25μL，Mix1μL，PPRV-F、PPRV-R、SBV-F、SBV- R、KBV-F和KBV-R各0.5μL，PPRV、SBV及KBV模板分别3μL，RNAse-freeH₂O12μL；

PCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72 ℃延伸30s，共计35个循环；72℃再延伸10min；

结果观察：取10μLPCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观 察结果。

进一步的，本发明建立的方法，其特征在于包括了本发明所述的引物。

更进一步的，本发明所述的引物用于检测小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库 布病毒。

所述的步骤用于检测小反刍兽疫病毒、施马伦贝格病毒和库布病毒的单一感染或 混合感染。

本发明所述的应用或者检测方法不仅仅用于牛羊养殖场的临床样品检测，还可以 应用于城市动物园、野生动物园中的反刍动物样品检测。