[发明专利]布鲁氏菌104M疫苗株敲除Omp25基因的重组菌及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌104M疫苗株敲除Omp25基因的重组菌及应用。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(BruceLLa)感染引起的一种慢性传染性疾病，也是世界范围内危害公共卫生安全的重大人畜共患传染病。在家畜中，牛、羊、猪最常发生，且可传染给人和其他家畜，其特征是生殖器官和胎膜发炎，引起母畜流产、公畜不育和各种组织的局部病灶，患病的牛、羊、猪、犬等也是人类布鲁氏菌病的主要传染源。人感染布鲁氏菌病可以引起发热、关节痛、疲乏无力，部分患者转为难以治愈的慢性病人。布鲁氏菌病在全世界范围内广泛流行，自2000年以后，我国人畜布鲁氏菌病发病率逐年上升，对畜牧业发展带来巨大危害，同时给我国公共卫生安全带来了巨大威胁，防控形势十分严峻。布鲁氏菌病的疫苗免疫是控制布病的有效方法，但是目前我国使用的人布鲁氏菌疫苗104M的安全性还存在很多问题。

全球预防动物布鲁氏菌感染的疫苗主要有S19、Rev1和RB51。人用布鲁氏菌疫苗为BA-19(Br.Abortus缩写)和104M(Mockba的缩写)菌苗。1923年美国人Buck从牛体中分出一株牛种19号弱毒菌种，制成兽用19活菌苗。1946年苏联研究人员从19号菌种的变异菌落中选出一种纯系光滑型菌体，称之为BA-19菌苗，1951年正式用于人群接种。104M菌苗是上世纪五十年代，在苏联中部地区病牛的胎盘中分离出一株牛种菌，该菌种编号为104M(Mockba的缩写)。小量豚鼠实验证明该菌种对动物的免疫原性优于BA-19，毒力较BA-19强，在之后的十余年中苏联学者利用实验动物和家畜对104M进行了大量的研究，并少量用于人体的研究，证明它在一定条件下使用，对人和动物有效。我国引用该菌种后，于1959年-1965年进行了系统的研究，证明对人群预防布鲁氏菌病感染有效，优于BA-19菌种。1965年我国正式批准生产人用皮上划痕104M布鲁氏菌活疫苗。但是，使用过程中发现104M菌苗和BA-19一样，能使被接种的机体产生过敏反应，表现局部皮试敏感性增高及出现某些临床症状，存在着一些严重的问题而逐渐不被使用。其主要问题为：一、接种采用皮肤划痕的方法，不仅疼痛而且让人难以接受；二、因其是弱毒疫苗株，接种后副反应也较大，可致接种人员感染；三、免疫后与自然感染无法区分，严重地影响着对布病的诊断与检疫工作。

布鲁氏菌的毒力因子与布鲁氏菌病的发病及免疫机制、治疗及预防等均关系密切。由于现代分子生物学领域的不断进步，对布鲁氏菌毒力因子的认识也逐渐深化。目前公认的布鲁氏菌毒力相关因子有：脂多糖合成基因、BvrR/BvrS双组分调控蛋白基因、 IV型分泌系统、H₂O₂酶基因、超氧歧化酶基因、外膜蛋白、热休克蛋白等。

外膜蛋白不仅是布鲁氏菌的结构蛋白和功能蛋白，而且也是布鲁氏菌重要的抗原和毒力因子。对外膜蛋白及其基因的深入研究是十分重要，可以为布鲁氏菌病的诊断、分型和新型疫苗的研制提供理论上的支持。Omp25是OmpA家族成员之一，属于布鲁氏菌第3组外膜蛋白Omp25/Omp31家族中的一员，是布鲁氏菌的重要外膜蛋白，在维持细菌外膜结构稳定性中发挥着重要作用。

基因缺失疫苗作为新型的基因工程疫苗之一，对预防和控制布病具有广阔的研究前景。目前布鲁氏菌弱毒疫苗株是实践应用中控制布鲁氏菌最有效的疫苗，但多数疫苗表现出一定的毒性，当在怀孕前使用会引起流产，并且免疫所产生的抗体难以与自然感染区别。因此，急需研制一种能够用于人的安全、有效免疫的布鲁氏菌疫苗。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Omp25蛋白活性得到的菌。

上述重组菌中，所述降低和/或抑制布鲁氏菌104M中Omp25蛋白活性为抑制或沉默布鲁氏菌104M中Omp25蛋白编码基因的表达。

上述重组菌中，所述抑制或沉默布鲁氏菌104M中Omp25蛋白编码基因的表达为敲除布鲁氏菌104M中Omp25蛋白编码基因。

上述重组菌中，所述敲除布鲁氏菌104M中Omp25蛋白编码基因为将布鲁氏菌104M中Omp25蛋白编码基因替换为抗性基因。

上述重组菌中，所述布鲁氏菌104M中Omp25蛋白编码基因替换为抗性基因均采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；

所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。