[发明专利]一种脐血NK细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别是涉及一种脐血NK细胞的体外扩增方法及其试剂盒与其在制备肿瘤免疫治疗药物及肿瘤免疫治疗中的应用。

背景技术

自然杀伤细胞(Nature killer cell，NK)是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，其细胞形态也与T、B细胞不同，NK细胞是胞浆中含嗜天青颗粒的大颗粒淋巴细胞，广泛存在于淋巴器官和外周组织中，在正常外周血中约占淋巴细胞总数的5％-10％，脾中占1％-2％，淋巴结和骨髓中也有NK细胞存在。NK细胞作为人体天然免疫的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，在免疫监视、免疫防御中起着十分重要的作用。长期以来的研究表明在某些疾病的发生过程中，如肿瘤、自身免疫性疾病、衰老相关性疾病和HIV感染等，会导致NK细胞比例、数量和功能降低。2012年美国疾病控制中心报告NK细胞的活力和数量是人体健康的重要保证，几乎所有疾病的发病都与NK细胞的活性明显不足有关。当人们患有某种疾病时，无论是慢性的、偶发性的或是急性的，NK细胞的活性都在平均水平以下。让NK细胞恢复到高水平的活性，是比较好的治疗疾病方法。与T淋巴细胞不同，NK细胞不需预先刺激就可直接溶解破坏肿瘤细胞和病毒感染细胞，通过分泌穿孔素、丝氨酸蛋白酶如颗粒酶A和B、硫酸软骨素蛋白聚糖等分子降解细胞膜、破坏靶细胞完整性而发挥溶细胞效应；NK细胞表面表达FasL(Fas ligand)和TRAIL(TNF-related opoptosis-inducing ligand)可通过与靶细胞上的受体结合引起靶细胞的凋亡；活化后NK细胞会释放大量的干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等细胞因子；另外通过细胞膜FcγRIII(CD16)与抗体Fc段结合从而介导抗体依赖的细胞毒性作用。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，利用NK细胞为靶点的免疫治疗对疾病的早期预防、控制和治疗具有重要意义。

近年来，免疫治疗己经成为继手术、放化疗及内分泌治疗之后的第四大治疗模式，并逐渐受到重视。过继性细胞免疫治疗法作为免疫治疗方法的一种，在临床研究方面取得了较大的进展。目前已经开展自体NK细胞过继免疫治疗应用于血液肿瘤(急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病等)和实体瘤(脑胶质瘤、肾癌和恶性黑色素瘤)的临床研究，安全性得到肯定，但临床试验的结果并不尽如人意，将自体外周血进行 NK细胞分选后回输，观察到体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤增强，但是生存率和复发率与对照组相比并无改善，可能与肿瘤在发展过程中容易对自体NK细胞形成免疫逃避有关，而且NK细胞过继性免疫治疗的临床试验受试者往往都是经过多种化疗失败的极度晚期的患者，瘤负荷重，机体免疫力差，NK细胞的功能有严重缺陷。要提高NK细胞的临床治疗疗效就必须改变以往的治疗策略。为了克服这些缺陷，异体来源的NK细胞是一个比较好的选择。有学者研究通过移植异体NK细胞治疗白血病患者，发现能延缓复发，且不引起移植物抗宿主病，引起人们对NK细胞的同种异体反应性的关注。从目前的临床研究的结果来看，异源性NK细胞在完全缓解率、无事件生存期、复发和死亡率方面明显优于自体NK细胞，而且异源性NK细胞并不伴随移植物抗宿主反应。NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力依赖于NK细胞表面活化性受体和抑制性受体间的信号平衡调控，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)组成与主要组织相容性I类(MHC-I)结合的受体家族，对调节人NK细胞的活化阈值起重要作用。最近越来越多的研究表明利用KIR受体/MHC-I配体的错配，筛选最优的供体能大大增强NK细胞对受体肿瘤细胞的杀伤能力，提高NK细胞过继免疫治疗的效果。当前基于KIR的供者选择对提高造血干细胞/骨髓的移植和肿瘤的过继免疫治疗方面的研究倍受关注。异源性NK输注已经成为临床上NK细胞过继免疫治疗的新策略(Lim O,Jung MY,Hwang YK,Shin EC:Present and Future of Allogeneic Natural Killer Cell Therapy.Frontiers in immunology 2015,6:286.)。脐血作为现成的异源性资源，无伦理问题，来源丰富，更容易找到最优的供者，且脐血中T淋巴细胞发育不成熟,多为幼稚细胞，移植后发生急性和慢性移植物抗宿主病的几率低、程度轻，所以脐血已经成为异源NK细胞极具前景的来源(Shaim H,Yvon E:Cord blood:a promising source of allogeneic natural killer cells for immunotherapy.Cytotherapy 2015,17(1):1-2.)。临床输注NK细胞，需要足够的细胞纯度和细胞数量，但NK细胞在脐血细胞中所占比例较低，数量也很少，需要经过体外分离及培养扩增，获得大量高纯度的NK细胞才能满足临床应用。因而如何获得高纯度、高质量的NK细胞成为NK细胞过继免疫治疗的关键(Klingemann H:Challenges of cancer therapy with natural killer cells.Cytotherapy 2015,17(3):245-249.)。