[发明专利]一种新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被有新城疫病毒抗体的受体微球、生物素标记的新城疫病毒抗体和包被有链霉亲和素的供体微球；所述受体微球为包被有发光化合物和镧系元素的纳米微球，所述供体微球为包被有光敏剂和链霉亲和素的纳米微球。

2.根据权利要求1所述新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，所述受体微球上包被的新城疫病毒抗体与生物素标记的新城疫病毒抗体为一对配对抗体。

3.根据权利要求2所述新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，所述配对抗体采用如下方法获得：将新城疫病毒免疫BALB/c小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合，对融合后的细胞进行间接ELISA筛选，选择阳性克隆进行2次亚克隆，选择2次亚克隆后阳性杂交瘤细胞株进行血球凝集抑制试验和竞争ELISA试验，得到分泌配对抗体的杂交瘤细胞2A5和4E11，用2A5和4E11分别腹腔注射BALB/c小鼠，并采用辛酸-硫酸铵法进行抗体纯化，得到一对配对抗体。

4.根据权利要求3所述新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，将所述新城疫病毒免疫BALB/c小鼠前，还对新城疫病毒进行了纯化，具体纯化步骤如下：

1）将新城疫病毒疫苗进行鸡胚尿囊腔接种，收集鸡胚尿囊液；

2）对收集的尿囊液进行差速离心，先于4℃5000rpm/min下离心15min去沉淀，后于4℃10000rpm/min下离心15min去沉淀，最后于100000g下离心2h弃上清液，用PBS缓冲液溶解沉淀，备用；

3）对步骤2）差速离心后的溶液进行SUPERDEX200凝胶过滤柱洗脱纯化，收集第一个洗脱峰，得到纯化的新城疫病毒。

5.根据权利要求1所述新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，还包括新城疫病毒的参考标准液，所述参考标准液的溶剂为pH7.8含有50mmol/LTris–HCl、质量浓度1.5%BSA、质量浓度0.9%NaCl、质量浓度0.05%NaN3和质量浓度0.01%Tween-20的缓冲溶液，所述参考标准液的溶质为新城疫病毒。

6.根据权利要求1所述新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，将所述包被有新城疫病毒抗体的受体微球与1xAphaLISA缓冲液按1:100~200体积比稀释，所述包被有链霉亲和素的供体微球用1xAphaLISA缓冲液稀释至终浓度为40μg/mL。

7.根据权利要求1所述新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒，其特征在于，将所述生物素标记的新城疫病毒抗体与1xAphaLISA缓冲液按1:200~400体积比稀释。

8.采用权利要求1~7任一所述新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，在微孔板中依次加入标准品或待检测样品、包被有新城疫病毒抗体的受体微球和生物素标记的新城疫病毒抗体，37℃振动孵育15~20min；然后在避光条件下加入包被有链霉亲和素的供体微球，37℃振动孵育15~20min后在AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值；其中，所述标准品或待检测样品、包被有新城疫病毒抗体的受体微球、生物素标记的新城疫病毒抗体和包被有链霉亲和素的供体微球的加入体积比为1:1:1:7。

9.根据权利要求8所述采用新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，在微孔板中依次加入标准品或待检测样品25μL、包被有新城疫病毒抗体的受体微球25μL和生物素标记的新城疫病毒抗体25μL，37℃振动孵育15-20min；然后在避光条件下加入包被有链霉亲和素的供体微球l75μL，37℃振动孵育15-20min后在AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值。

10.根据权利要求8所述采用新城疫病毒双抗体夹心AlphaLISA检测试剂盒进行检测的方法，其特征在于，所述在AlphaScreen/Lisa检测仪上检测信号值，激发光波长为680nm，发射光检测波长为615nm。