[发明专利]一种通用型总蛋白质提取试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种通用型总蛋白质提取试剂，此通用型总蛋白质提取试剂可以从多种生物样本中显著高效的增加蛋白质提取效率并且操作非常简便。

背景技术

蛋白质组学(proteomics)是指以基因组编码的所有蛋白质为研究对象，从细胞或组织整体水平上研究蛋白质的组成及其变化规律，从而深入认识有机体的各种生理和病理。与传统蛋白质研究比较，蛋白质组学研究体现了全面性、整体性、高通量、大规模的特点。蛋白质组学的研究对于已完成基因组计划的理论预测的蛋白质组进行实证分析具有无法替代的重要作用。蛋白质组学技术较为复杂，包括蛋白质分离、鉴定和信息分析三方面的内容。其中，蛋白质快速高效的分离是蛋白质的核心技术之一。

蛋白质是一种具多相极性的生物大分子，离开其天然的环境，蛋白质分子极不稳定，在细胞中和抽提液中蛋白质的性状也不尽相同。从生物材料中提取蛋白质，首先需要进行细胞的破碎后将处于细胞不同部位的蛋白质释放出来，溶入已知成分的溶液中。该步骤是蛋白质提取和纯化的重要环节，它直接影响蛋白质的产。从正常生物材料中提取各种蛋白质均需要对提取溶液有特定的条件。如果不能满足这一条件，蛋白将很快失去生物学活性。因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。提取条件的确定就是在最大程度的破碎生物材料的细胞后，找到能够使细胞内的总蛋白质充分溶解进入适合保存蛋白质的液体环境的组成及条件，这种能够使细胞内蛋白充分高效溶出的外界液体环境即为蛋白质提取试剂。由于不同生物大分子结构及理化性质的不同，蛋白质提取试剂也不一样。即同一类生物大分子由于选用材料不同，蛋白质提取试剂的差别也很大。因此很难有一个统一标准的提取试剂对提取任何蛋白质均可循用。本发明就是在对不同生物样本体内蛋白质存在环境的研究和总结的基础上，设计出可以针对不同的生物样本(植物、动物、微生物)的通用型高效蛋白提取试剂，不仅大大节省了不同生物样本需要筛选不同提取试剂的工作时间，而且还可以高效提取不同生物样本的总蛋白质。

发明内容

本发明目的之一是提供一种能够适用于不同生物材料的总蛋白质提取试剂；

本发明目的之二是提供一种高效总蛋白质提取试剂，提取效率较其他方法提高3倍以上；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

缓冲液的选择：缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH的变化，选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定性以及保证实验的重复性十分重要。大多数植物细胞在37℃的生理状况下pH为5.0-7.5，微生物及动物细胞为7.0-8.5。在通常的缓冲液体系中，主要包括阳离子缓冲液体系和阴离子缓冲液体系，阳离子缓冲液体系首选是三羟甲基氨基甲烷(Tris)，阴离子缓冲液体系首选磷酸盐缓冲液。混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范围。因此，本发明采用了Tris和磷酸盐的混合缓冲体系，这种缓冲体系具有更宽的缓冲范围，更好的适应于包括了动物、植物、微生物在内的各种生物材料中总蛋白质的稳定存在。当选定一种缓冲液之后，一般使用其最低的浓度以避免非特异性的离子强度的影响，通常Tris缓冲体系以50mmol/L作为实验的起始浓度，因此本发明中最终确定了50mM Tris-Cl，10mM Na₂HPO4，2mMNaH₂PO4，140～150mM NaCl作为混合缓冲体系。

离子强度的选择：通常使用0.1～0.2mol/L KCl或NaCl来模拟生物材料体内的生理状况下的离子强度，本发明中采用了140～150mM NaCl以模拟生物材料体内的生理状况下的离子强度。

螯合剂的选择：为了避免金属离子的干扰，应在总蛋白质提取溶液中加入特异金属离子的螯合剂，最常用的金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)，EDTA对大多数金属离子有非特异的亲和性，使用浓度一般为0.1～5mmol/L。

还原剂的选择：在生物材料的细胞中有许多种还原成成分，如谷氨酰胺可防止蛋白质氧化。但是细胞一旦破碎，由于和氧的接触以及稀释作用而引起抗氧化成分的减少，使许多蛋白质被氧化而失去活性。为了有效防止蛋白质的氧化作用，可以选择还原剂以防止蛋白被氧化。常用的还原剂有β-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)，在蛋白质制备过程中长期储存时加入1～5mmol/L的DTF。