[发明专利]一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法。

背景技术

口服免疫能够产生有效的局部黏膜免疫和机体系统免疫，是一种有效的免疫途径。但是，口服递送蛋白抗原要面对诸多挑战，一是经口服蛋白抗原需要克服胃内酸降解和胃肠道内蛋白酶的降解，二是免疫系统对抗原摄取量低的问题。

为了增加机体免疫细胞对抗原的摄取，我们利用了甘露糖受体在巨噬细胞和树突状细胞等抗原提呈细胞表面大量表达这一特点，发明了一种简便的甘露糖化壳聚糖(MCS)的制备方法(中国专利，CN102477107B，授权日：2013年10月9日)。用甘露糖基修饰壳聚糖，能选择性提高抗原提呈细胞对疫苗的摄取、提高靶向效率，增强疫苗的免疫效果。我们制备了MCS抗肿瘤DNA疫苗，结果表明该疫苗经粘膜免疫具有显著的效果(Molecularpharmaceutics.2013，10：2904-14)，说明MCS用于粘膜免疫可以靶向APC并增加其对抗原的摄取。

蛋白疫苗在胃肠道中容易失活和降解是口服疫苗有效性的最大阻碍。而将MCS纳米粒用于疫苗的口服给药时，也存在这一问题。由于其在胃部酸性环境会破坏形成的纳米粒结构，从而导致包载的蛋白在胃内突释及水解。因此，本发明选择了pH敏感型材料包覆壳聚糖纳米粒，由于pH敏感型材料在胃内pH条件下不溶，可保护MCS纳米粒在酸性环境中的稳定性。常用的pH敏感型材料如丙烯酸树脂类(Molecules，2013，18(6)：6734-6747.)、海藻酸盐(JournalofDrugTargeting，2011，20(1)：76-84.)等，但是已报道的制备方法多为乳化法，涉及有机溶剂以及较为剧烈的制备条件，在制备过程中对蛋白药物可能产生破坏，影响其活性。发明所采用的聚合物为甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯(商品名：EudragitL100)，利用静电作用将pH敏感型聚合物包覆于MCS纳米粒上。这种聚电性纳米粒结构较为致密，比较一些“包裹”技术，没有蛋白泄露问题。另外，在纳米粒外巧妙的包覆一薄层肠溶衣，在胃中可以有效保护蛋白结构完整性。且本发明所述疫苗为纳米级颗粒，比较大粒径的微粒系统在肠道派尔氏集合淋巴结的摄取效果更佳。

目前未见用该方法制备pH敏感型MCS纳米粒作为口服蛋白疫苗的相关文献和专利。

发明内容

本发明的目的是克服目前口服蛋白疫苗存在的胃肠道稳定性低和体内吸收差的问题，提供一种pH敏感型的口服蛋白疫苗的制备方法。

本发明提供的pH敏感型口服蛋白疫苗，是用聚合物材料MCS制备包覆蛋白抗原的纳米粒，再利用pH敏感型材料对纳米粒进行包覆，使载有蛋白抗原的纳米粒具有pH敏感性。

本发明制备的疫苗经口服后，能够在通过胃部时保护蛋白抗原不被酸和酶降解破坏，进入小肠后，具有pH敏感性的衣膜溶解，通过MCS的甘露糖配体与抗原提呈细胞表面的甘露糖受体结合，通过糖类识别机制，借助受体介导的抗原提呈细胞主动靶向作用，增加机体免疫系统对抗原的摄取，有效激活免疫应答，增强抗原特异性抗体。

本发明提供一种制备前述纳米粒的方法，采用的材料为甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物(Eudragit)，该共聚物在pH大于6的条件下溶解，其羧基荷负电，在pH小于6的条件下不溶。本发明利用静电结合作用自组装形成纳米粒，再通过调节pH的方法将pH敏感型材料固化在纳米粒表面，形成致密的衣膜。该过程无需有使用机溶剂，制备条件温和，有利于保护蛋白药物的活性。本发明所述的纳米粒能够抵抗胃肠道环境中低pH以及酶等对蛋白抗原的破坏，因而可以作为口服蛋白疫苗的载体。

具体制备方法如下：

精密称取一定量的MCS，加入醋酸溶液中，配制为一定浓度的甘露糖化壳聚糖溶液。另外配制一定浓度三聚磷酸钠、蛋白药物和pH敏感型聚合物溶液。取MCS溶液，室温下磁力搅拌，滴加蛋白药物溶液，搅拌5min，再滴加入三聚磷酸钠溶液，维持搅拌30min，即形成MCS纳米粒混悬液。将上述MCS纳米粒混悬液滴加入pH敏感型聚合物溶液中，持续磁力搅拌20min，用HCl溶液调节混悬液的pH值，固化纳米粒，室温搅拌20min，即得pH敏感型口服蛋白疫苗。pH敏感型口服蛋白疫苗的透射电镜图见图1。