[发明专利]黑色素瘤易感基因检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种黑色素瘤易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估黑色素瘤发病的风险级别。

背景技术

恶性黑素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤。皮肤黑素瘤表现为色素性皮损在数月或数年中发生明显改变。虽其发病率低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高，因此早期诊断、早期治疗很重要。恶性黑素瘤大多发生于成人，巨大性先天性色素痣继发癌变的病例多见于儿童。

经过基因连锁、细胞遗传学、肿瘤细胞的杂合子丢失研究，推测在染色体9p21区域存在恶性黑色素瘤易感性基因。若家庭内有黑色素瘤患者，那么其发生黑色素瘤的相对危险与无家族史者比是2－3，已经发现有黑色素瘤家谱。黑色素瘤在家族中聚集虽然不常见，与大家族黑色素瘤有关的基因可能在普通人群为基础的黑色素瘤中仅起很小的作用。在黑色素瘤家族中已经发现两个基因，CDKN2A和CDK4，分别位于9和12号染色体上。在世界范围内的家族性黑色素瘤有高达25％的CDKN2A基因突变，而CDK4仅见于几个罕见家族。CDKN2A转录外显子1a、2、3区域编码p16蛋白，该蛋白能抑制细胞周期蛋白D1与CDK4或CDK6复活体的激活。而上述复合体的作用是参与视网膜母细胞瘤蛋白的磷酸化，使细胞跨过细胞周期的G1期，由于p16蛋白对上述复合体具有抑制作用，所以就可以通过下调细胞周期而抑制肿瘤。普通人群p16突变频率估计为0.01％。

综上所述，鉴于CDKN2A基因在家族性黑色素瘤变过程中有着不可忽视的作用，可以将其作为遗传易感因素来检测是否发生突变，及时筛查出易患黑色素瘤的高危人群，从而有针对性的预防和治疗黑色素瘤，这对于降低黑色素瘤的发病率有非常重要的意义。

发明内容

基于本发明提供一种黑色素瘤易感基因检测试剂盒。试剂盒检测CDKN2A基因外显子1a、2序列是否发生突变，可作为评估黑色素瘤发病的危险因子的基础。

本试剂盒包括检测CDKN2A基因外显子1a和外显子2序列的特异性扩增引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O)；

本发明试剂盒的组分和含量包括：10×PCR反应缓冲液300ul；2.5mM dNTP混合液 300ul；5U/ul Taq DNA聚合酶30ul；10uM特异性引物对(每条引物各150ul)；ddH2O 2ml

本试剂盒供一百人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

步骤1：抽提DNA模板，利用商品化的试剂盒提取受检者基因组DNA。

步骤2：PCR扩增反应

使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物：

SEQ.ID NO.1：5'TGTGGGCAGGCTGTGGTT3'

SEQ.ID NO.2：5'CTCCCATATTGGGGCCTGCA3'

SEQ.ID NO.3：5'TGACCTTGCGGGACCTTAG3'

SEQ.ID NO.4：5'CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3'

PCR扩增的反应体系为：10×PCR反应缓冲液2.5ul；2.5mM的dNTP混合液2ul、5U/ul Taq酶0.2ul、DNA模板20ng左右、10uM正向引物反向引物各1ul、添加去离子水至25ul；

PCR扩增的反应条件为：95℃5分钟变性和酶激活，94℃30秒变性，55℃45秒退火，72℃2分钟延长，循环35次，最后72℃延长10分钟。

步骤3：PCR扩增产物纯化，利用商品化的试剂盒对扩增产物进行纯化。

步骤4：DNA测序反应，按照DNA片段测序的标准操作进行测序和分析，依据所有测序峰图最终分析目的基因片段的序列。

步骤5：基因型分析

熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。

实施例2.