[发明专利]阳性和阴性食源性致病菌的快速鉴别方法

权利要求书

1.阳性和阴性食源性致病菌的快速鉴别方法，其特征在于，该方法为：利用纳米复合 材料作为增强剂，通过与阳性和阴性食源性致病菌之间产生的吸附作用对拉曼信号放大， 采用拉曼光谱对不同菌种进行检测，经对检测结果进行线性判别分析，同时结合多种化学 计量学方法，实现对阳性和阴性食源性致病菌的快速鉴别。

2.根据权利要求1所述的阳性和阴性食源性致病菌的快速鉴别方法，其特征在于，该 方法具体包括如下步骤：

1)菌种活化：将阳性和阴性食源性致病菌的菌液进行梯度稀释，选择合适的梯度涂平 板，在37℃培养箱中培养16-18h，选择细菌菌落数在50～80之间且菌落直径为1-2mm 的平板用于后续拉曼图谱的采集；

2)增强剂制备：首先，将盛有4g三聚氰胺粉的陶瓷坩埚放入马弗炉中，以10Kmin^-1的升温速度将马弗炉加热至520℃，在此温度维持4h，冷却至室温得到黄色产物即为石墨 碳化氮(g-C₃N₄)；随后，采用化学还原法进行金纳米颗粒的制备：将30mgKAuCl₄溶解 于50ml超纯水中电热套加热煮沸后加入2.0ml的1％的柠檬酸三钠还原，继续煮沸35min 后冷却，得到粒径约50nm金纳米颗粒；最后，将0.02g石墨碳化氮在磁力搅拌状态下加 入到20mL纳米金溶液中，搅拌1h后，将混合溶液转移到5mL离心管中，5000rpm离心 5min，最终得到石墨碳化氮/金纳米颗粒复合材料(g-C₃N₄/AuNPs)，石墨碳化氮/银纳米颗 粒合成方法同上；

3)拉曼图谱检测：用无菌接种环挑取分散的菌落(20～70)，置于1.5ml无菌缓冲溶液 中振荡，9000rpm/min离心5min，重复两次操作完成洗涤，弃掉上清液，得到待测细菌 样品，将得到的待测菌样用100μL的超纯水溶解混匀，取10μL的菌液加至盛有300μL 增强剂的96孔塑料皿中，混合物静置混合10～15s，进行拉曼光谱检测，拉曼光谱检测条 件为：激光波长为785nm，激光功率为100-300mW，积分时间为5-10s，采集次数为2-5 次，检测范围为400-2000cm^-1，激光器与检测样品的距离为1-3mm，光斑直径为100μm；

4)数据处理及分析：将得到的阳性和阴性食源性致病菌的拉曼光谱数据进行LDA线 性判别分析，利用多种化学计量学方法对拉曼数据进行处理；

5)透射电镜图像拍摄：从上述96孔板中吸取30μL菌样与增强剂混合样，将其滴加 到铜网上，进行透射图像拍摄；

6)未知菌属检测：取一种以上未知菌属样本，对照步骤3)，获取该未知菌属的拉曼 图谱，与步骤3)所得的标准图谱对比，从而实现对未知菌属的分类及鉴别。

3.根据权利要求1所述的阳性和阴性食源性致病菌的快速鉴别方法，其特征在于，所 述增强剂为石墨碳化氮/金纳米溶胶或石墨碳化氮/银纳米颗粒复合材料。

4.根据权利要求1所述的阳性和阴性食源性致病菌的快速鉴别方法，其特征在于，所 述阳性和阴性食源性致病菌至少包括大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金 黄色葡萄球菌、分枝杆菌、单增李斯特菌。

5.根据权利要求1所述的阳性和阴性食源性致病菌的快速鉴别方法，其特征在于， 所述增强剂的使用量与食源性致病菌的比例为300μl∶20活菌数～300μl∶70活菌数(cfu/ml)之 间。