[发明专利]一种海洋硫酸多糖的快速纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋硫酸多糖的纯化技术领域，特别是涉及一种利用QFF(Q Sepharose Fast Flow anion-exchange，琼脂糖阴离子交换树脂)强阴离子填料和减压抽滤装置快速纯化硫酸多糖的方法。

背景技术

海洋硫酸软体动物中富含硫酸多糖，且结构往往具有高度重复结构序列，易于构效关系的探究以及质量控制。其中，海参是目前主要海洋硫酸多糖的来源之一。海参主要有两种类型的硫酸多糖：海参硫酸软骨素(Sea Cucumber Chondroitin Sufate,SC-CHS)和海参岩藻聚糖硫酸酷(sea Cucumber Fucan,SC-FUC)。其中，海参硫酸软骨素是一种带岩藻糖支链的酸性粘多糖，主要由D一乙酰氨基半乳糖、D一葡萄糖醛酸和L一岩藻糖组成的分子杂多糖，是海参多糖的重要成分。海参硫酸软骨素具有降血脂及抗肿瘤等生理活性，临床上可用于预防动脉粥状硬化等多种疾病；海参岩藻聚糖硫酸酷是由L-岩藻糖所构成的直链多糖。二者的糖组成不同，糖链上都有部分轻基发生硫酸酯化，两种海参多糖的特殊结构，均为海参所特有。另外海胆中富含有岩藻聚糖硫酸酯，且结构简单，重复性高。海洋硫酸多糖存在着硫酸化程度的不一致性、显微结构和分子量的不均匀性以及残基数量的多变性等特点，造成了海洋硫酸多糖纯化和结构分析的复杂性。

硫酸多糖的提取方法一般是酶解，氯代十六烷基吡啶沉淀，分级醇沉。低浓度的乙醇(<40％)可将硫酸软骨素沉淀出来，高浓度的乙醇(>60％)可将岩藻聚糖硫酸酯沉淀出来。而通过以上方法得到是多糖粗提物，要得到具有较高生物活性的硫酸多糖，还要进行分离和纯化，多糖的分离和纯化主要包括两个步骤，一是分离提取物中非多糖组分，如杂蛋白、色素、低聚糖及一些小分子化合物等杂质，二是对分子量范围很宽的多糖进行分级，得到具有一定分子量范围的纯多糖。

从多糖中分离蛋白质方法主要有Sevag法，三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法等化学方法。Sevag法在实验室中最为常用，但是其不足之处在于：工艺流程较长；多糖损失多；一次只能除去少量蛋白质，一般需要反复多次才能将蛋白质除尽；溶剂使用易挥发的氯仿，消耗量大，对人体有危害，污染环境。三氟三氯乙烷法脱蛋白的效率较高，但也因其易挥发，不宜大量使用。从海洋软体动物中提取的硫酸多糖，由于前期的酶解过程，所得到的酸性多糖中蛋白的含量并不高。

海洋动物中含有大量色素，这就给海洋硫酸多糖的纯化带来很大困难，不仅对分光光度计的准确度有很大影响，而且还严重影响成品的品质。现有的方法主要采用活性炭吸附脱色，该方法脱色效果一般，且活性炭对多糖吸附严重。H₂O₂虽然脱色效果不错，但会降解多糖，从而影响多糖的生物活性，因此使用其脱色要慎重考虑。对于酸性多糖脱色纯化，纤维素阴离子交换柱层析是最常见的方法。然而，层析柱的方法耗时长，纯化率低(<25％)，不能满足大量生产的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种海洋硫酸多糖的快速纯化方法。本发明具有简化纯化步骤，节省纯化时间，提高纯化效率；不引入有机萃取溶剂，降低成本，无环境污染；方法稳定，重现性好；设备简单，条件容易控制的特点。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种海洋硫酸多糖的快速纯化方法，该方法包括如下步骤：

(1)、将海洋硫酸粗多糖溶于磷酸缓冲盐中，得到海洋硫酸粗多糖的水溶液；

(2)、将步骤1得到的海洋硫酸粗多糖的水溶液倒入QFF填料中，海洋硫酸粗多糖与QFF填料的质量体积比为1/100-200(g/ml)；待海洋硫酸粗多糖吸附于QFF填料后，用磷酸缓冲盐洗脱，真空抽滤；

(3)、向步骤2中真空抽滤后的混合物中加低浓度氯化钠溶液，洗脱，真空抽滤；

(4)、向步骤3中真空抽滤后的混合物中加高浓度氯化钠溶液，洗脱，真空抽滤；

(5)、将步骤4中真空抽滤后收集得到的纯多糖液离心，醇沉，透析一天后冻干，得海洋硫酸多糖；

所述步骤1和步骤2中，所述磷酸缓冲盐是浓度为01M的KH₂PO₄的水溶液，pH值为6.3；所述步骤3中，所述低浓度氯化钠溶液是浓度为0-0.5M的氯化钠的水溶液；所述步骤4中，所述高浓度氯化钠溶液是浓度为1.5-4M的氯化钠的水溶液；所述步骤5中，使用透析袋透析。