[发明专利]一种奶牛隐孢子虫的快速检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种奶牛隐孢子虫的快速检测方法及检测试剂盒。

背景技术

隐孢子虫卵广泛的存在于环境当中，可以感染多种脊椎动物，造成不同程度的腹泻甚至死亡。对于奶牛养殖业，隐孢子虫病是一种重要的寄生虫病，可引起犊牛腹泻，抑制幼畜的生长发育,降低畜产品的产量和数量，造成饲料的大量浪费。同时奶牛粪便是重要的传染源，威胁人类的健康。一旦感染隐孢子虫，没有有效的治疗方法。所以建立一种快速简便的奶牛隐孢子虫诊断方法显得尤为重要。

发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，提出一种快速简便检测奶牛粪便中隐孢子虫的方法，可以实现临床现场检测；本发明还提供奶牛隐孢子虫的快速检测试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种奶牛隐孢子虫的快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下成分：月桂酰肌氨酸钠水溶液，吐温-20水溶液，引物探针混合液，PBST溶液，测流层析试纸条，RPA冻干酶和RPA反应预混液；

所述引物探针混合液中引物序列为：

上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；

下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；

探针序列为：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-SpacerC3-3'；

所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。

作为优选，每16μl所述引物探针混合液的制备方法为：将上游引物21pmol，下游引物21pmol，探针6pmol混合于16μl纯水中。

本发明的第二个目的是提供奶牛隐孢子虫的快速检测方法，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，步骤如下：

（1）将奶牛粪便溶解于装有月桂酰肌氨酸钠水溶液的容器中，将容器放入盛有沸水的锅中，盖上锅盖，利用沸水的余温孵育10-20分钟，之后在容器内加入吐温-20，使溶液中吐温-20的浓度约为5%-10%，得到含有隐孢子虫DNA的样品处理液；

（2）对样品处理液进行重组酶聚合酶扩增；扩增时所使用的引物和探针为：

上游引物：5'-CTATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG-3'；

下游引物：5'-biotin-CCTCCAATTGATACTTGTTAAGGGGTTTATAC-3'；

探针为：5'-FAM-ACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCG-THF-GCAAATTACCCAATCCT-SpacerC3-3'；

（3）将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验，如果试纸条为两条杠，则为隐孢子虫阳性，如果为一条杠，则为阴性。

作为优选，步骤（1）中所述月桂酰肌氨酸钠水溶液的质量百分比浓度为0.1%-0.2%。

作为优选，步骤（2）中所述重组酶聚合酶扩增的反应体系为：样品处理液2μl，引物探针混合液16μl，RPA反应预混液32μl，RPA反应冻干酶一份；反应条件为：在30℃-45℃条件下反应20-30分钟。

作为优选，步骤（3）中将扩增产物滴加到测流层析试纸条上进行检验的具体方法为：用无菌牙签沾取少许扩增产物与200μlPBST溶液混合，然后沾取一滴混合液滴加到测流层析试纸条的加样端，并将加样端竖直浸入装有200μlPBST溶液的离心管中，数分钟后观察结果；

所述PBST溶液的制备方法为：将1ml的吐温-20溶于1000mlPBS溶液中，混匀即可。

本发明的第三个目的是提供上述试剂盒在检测奶牛隐孢子虫中的应用，所述检测不以疾病的诊断和治疗为目的。

作为优选，所述奶牛隐孢子虫为感染奶牛的微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和瑞氏隐孢子虫。

本发明的第四个目的是提供一种从奶牛粪便中提取隐孢子虫DNA的方法，步骤如下：将奶牛粪便溶解于装有0.1%-0.2%月桂酰肌氨酸钠水溶液的容器中，将容器放入盛有沸水的锅中，盖上锅盖，利用沸水的余温孵育10-20分钟，之后在容器内加入吐温-20，使溶液中吐温-20的浓度为5%-10%，完成奶牛粪便中隐孢子虫DNA的提取。