[发明专利]一种乙醛‑DNA加合物的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA样本的理化检验技术领域，主要涉及DNA中N²-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）和1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪（LC- MS/MS）测定DNA中乙醛-DNA加合物的方法。

背景技术

乙醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物。主要产生于有机物的不完全燃烧，如工业生产、卷烟烟气、机动车尾气等。活泼的醛基不需要经过机体代谢就能够直接攻击生物体内亲核基团，如核酸中的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。乙醛形成的主要DNA加合物包括N²-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）和1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG），其中1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）是由Ethylidene-dG与乙醛进一步反应所得，该过程需要氨基酸的催化。N²-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）在单核苷酸状态下不稳定，需要将其在DNA酶水解阶段还原为N²-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）才能被检出。

目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有³²P-后标记技术、酶联免疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的乙醛-DNA加合物（Ethylidene-dG和Propano-dG）的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于DNA中乙醛-DNA加合物的同时定性定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种乙醛-DNA加合物的测定方法，即DNA中Ethylidene-dG和Propano-dG的测定方法，具体步骤如下：

a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液（乙醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM），对照组加入同等体积的PBS溶液。上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL。

b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂缓冲液（pH=7）中，加入30 mg的还原剂 NaBH₃CN，将Ethylidene-dG还原为Et-dG；加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经1 mL甲醇活化和1 mL超纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为100 ng/mL的[¹⁵N₅]Et-dG和[¹⁵N₅]Propano-dG。

c、标准工作液的配制：用甲醇分别配制不同浓度的Et-dG和Propano-dG标准工作溶液。

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。