[发明专利]人工合成的编码胸苷磷酸化酶蛋白的基因及其应用

说明书

本发明涉及人工合成的编码胸苷磷酸化酶蛋白的基因及其应用，属于生物工程领域。通过使用本发明的优化后的基因序列，来表达胸苷磷酸化酶突变体，能有效提高单位菌体的总酶活，可有效降低抗爱滋病药物中间体β‑胸苷的生产成本。只要一般的发酵车间（如氨基酸、维生素生产车间）即可进行投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及人工合成的编码胸苷磷酸化酶蛋白的基因及其应用，属于生物工程领域。

背景技术

胸苷是一种重要的医药原料中间体和生化试剂，在生物化工领域的研究和生产中有着十分广泛的应用。胸苷是制备抗爱滋病药——叠氮胸苷(AZT)的重要原料，但要求其含量必须在98％以上，而且其中的5-甲基尿苷的含量不能超过0.3％。目前胸苷的制备主要有化学合成和DNA酶解两种方法：由化学合成法所得到的胸苷粗品中含有油状物，色素，5-甲基尿苷等胸苷衍生物，并且存在光学异构体难以去除；工艺过程中亦需要使用大量有毒有害的有机溶剂，对环境污染亦存在危险。而酶解法通过水解RNA或DNA等天然物质，所得到的胸苷粗品中含有脱氧腺苷(dA)，脱氧胞苷(dC)，脱氧乌苷(dG)，脱氧肌苷(dI)等杂质，分离提取十分复杂。

胸苷磷酸化酶在生物合成核苷药物中具有重要作用。合成出的核苷药物被广泛应用于医药领域，如治疗艾滋病的HIV逆转录酶抑制剂齐夫多定(AZT)、双脱氧肌苷(ddl)、扎西他滨(ddC)等。

胸苷磷酸化酶可特异性作用于β-胸苷，催化β-胸苷可逆磷酸化反应，由β-胸苷生成脱氧核糖-1-磷酸及胸腺嘧啶，亦可由脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶生成β-胸苷。

我们通过对序列表中序列2所示的大肠杆菌MG1655的胸苷磷酸化酶蛋白进行定向突变，获得了序列表中序列4所示的突变的胸苷磷酸化酶蛋白，从而产生了本发明所要解决的问题，即如何使其在大肠杆菌内高效表达。

发明内容

我们通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。同时，在合成时引入以下位置的五个氨基酸突变：L10A，A209G，F210G，A221V，A413D，利用Primer Premier(http：//primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http：//genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。