[发明专利]鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物

说明书

本发明公开了鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物。本发明的牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)的特异性好，采用4条引物共识别目的片段6个特异性的区域。用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)的灵敏度高，环介导等温扩增最低能实现1fg OsHV‑1核酸的检测，PCR扩增仅能实现对100fg以上OsHV‑1核酸的检测，环介导等温扩增的检测灵敏度比PCR扩增高100倍。用本发明的引物组合物检测牡蛎疱疹病毒1型(OsHV‑1)结果可视化，适于批量样品的检测，也使基层及现场检测成为了可能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物。

背景技术

牡蛎疱疹病毒(OsHV)粒子呈六角形，直径70-90nm，具单层外膜，有的病毒粒子具浓密的类核，受感染的牡蛎消化腺呈苍灰色，散发性死亡，造成了严重的经济损失。此病常发生于发电站排出的热水养殖的牡蛎，发病水温为28-30℃，水温下降后，此病随之消失，发病与水温密切相关。

目前，常规的OsHV检测方法主要有电镜观察、免疫学方法(ELISA等)和PCR等，这些方法可以对OsHV进行特异的检测，但是具有明显的费时、费力、灵敏度低和特异性差等缺点。虽然PCR方法可以作为一种灵敏而特异的病原检测和鉴定技术，但PCR反应需要PCR仪等昂贵的设备，而且需要在实验室内，利用琼脂糖凝胶电泳方法对PCR产物进行分析，这在一定程度上限制了病原快速检测技术的发展。荧光实时定量技术的建立实现了对OsHV的定量检测，而且检测灵敏度很高，可以达到100拷贝病毒粒子，但是，该方法需要荧光实时定量PCR仪等昂贵的设备和试剂，这些局限性使得该方法很难得到推广使用。

近年来，一种新的恒温核酸扩增方法LAMP(loop-mediated isothermalamplification)，即环介导等温扩增技术已经被开发并应用。它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒温条件下进行核酸扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、成本低廉、产物易检测和不需要电泳仪以及PCR仪等优点。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏、特异性地鉴定牡蛎疱疹病毒。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合物。

本发明所提供的一种引物组合物(引物组合物甲)，由引物OsHV-F3、引物OsHV-B3、引物OsHV-FIP和引物OsHV-BIP组成；所述引物OsHV-F3、所述引物OsHV-B3、所述引物OsHV-FIP和所述引物OsHV-BIP均为单链DNA分子；所述引物OsHV-F3如序列表中序列1所示；所述引物OsHV-B3如序列表中序列2所示；所述引物OsHV-FIP如序列表中序列3所示；所述引物OsHV-BIP如序列表中序列4所示。

所述引物组合物的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型；(b)鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型。所述待测生物样品中的生物具体可为扇贝，更具体可为栉孔扇贝。

当应用所述引物组合物鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测病毒的基因组DNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果反应结果呈阳性，待测病毒为候选的牡蛎疱疹病毒1型；如果反应结果呈阴性，待测病毒为候选的非牡蛎疱疹病毒1型。

当应用所述引物组合物鉴定或辅助鉴定待测生物样品是否含有牡蛎疱疹病毒1型时，具体方法如下：以待测生物样品的总DNA或待测生物样品的总RNA反转录得到的cDNA为模板，采用所述引物组合物进行环介导等温扩增，如果反应结果呈阳性，待测生物样品疑似含有牡蛎疱疹病毒1型；如果反应结果呈阴性，待测生物样品疑似不含有牡蛎疱疹病毒1型。