[发明专利]一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法

权利要求书

1.一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法，包括：

（1）以大腹园蛛次壶腹腺丝MiSp的全长编码基因为模板，然后通过PCR扩增得到次壶腹腺丝MiSp的NT端基因片段MiSp-NT与CT端基因片段MiSp-CT，然后以大腹园蛛梨状腺丝PySp完整重复区Rp的编码基因作为模板，通过PCR扩增获得一个完整重复区的基因片段PySp-Rp；其中

NT正向引物：CGGGATCCCAACCAATCTGGACCAACCCA，SEQ ID NO.4所示；

反向引物：CTGGTCTAGGTGCAGGTGCTGGAGCGTTTCCATAACCTGCTGCAGTG；SEQ ID NO.5所示；

CT正向引物：CTCTATCTCAACTGGCAGCACCGGTAGCTGCATATGGTGGCGCAGG，SEQ ID NO.6所示；

反向引物：CCCTCGAG TTAACCTACATATTGGCCTACTGAATCCTGAAC；SEQ ID NO.1所示7；

PySp重复区正向引物为：

GCACTGCAGCAGGTTATGGAAACGCTCCAGCACCTGCACCTAGACC，SEQ ID NO.8所示；

反向引物为：CCTGCGCCACCATATAGDAGCTACCGGTGCTGCAGTTGAGATGAG，SEQ ID NO.9所示；

（2）将步骤（1）中三段基因片段MiSp-NT、MiSp-CT、PySp-Rp通过PCR技术得到完整基因片段MiSpNT-PySpRp-MiSpCT；三段基因片段MiSp-NT、MiSp-CT、PySp-Rp通过PCR技术具体为： 选取步骤（1）中NT的正向引物与CT的反向引物与三个扩增产物，再次进行PCR扩增；PCR条件为：98℃变性3min，65℃退火1min，72℃延伸5min，循环35次；其中完整基因片段MiSpNT-PySpRp-MiSpCT的基因大小为1551bp，共编码517个氨基酸，蛋白分子量为50.7KDa；

（3）将上述完整基因片段MiSpNT-PySpRp-MiSpCT、pLX质粒分别进行双酶切，然后进行纯化回收后混合，再加入T4连接酶反应，得到连接产物；其中pLX质粒由pET32a改造而来，在插入片段前只引入6个His标签；

（4）将上述连接产物转入DH5α感受态细胞中进行转化，37℃过夜培养后，挑取单克隆进行双酶切检查，将酶切正确的重组质粒pLX-MiSpNT-PySpRp-MiSpCT，转入BL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆接入LB培养基中，37℃过夜培养后，再转接入LB培养基中培养，然后加入IPTG诱导培养，收集菌体；

（5）将上述菌体重悬于裂解缓冲液Lysis Buffer中，高压破菌后，离心，收集沉淀，纯化、冻干，得到MiSpNT-PySpRp-MiSpCT蛋白粉末；

（6）将上述蛋白粉末加入六氟异丙醇溶解后，得到溶液，然后用针头吸取溶液注入75%的甲醇中，即得混合蛛丝蛋白纤维；其中蛋白粉末和六氟异丙醇的比例关系为100mg：1mL。

2.根据权利要求1所述的一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中NT端基因片段MiSp-NT大小为480bp，CT端基因片段MiSp-CT为435bp，基因片段PySp-Rp为636bp。

3.根据权利要求1所述的一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中进行双酶切为：加入内切酶BamH1与XhoI，37℃条件下反应2h进行双酶切；加入T4连接酶反应，反应温度为16℃，时间为1h。

4.根据权利要求1所述的一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法，其特征在于：步骤（4）中连接产物和DH5α感受态细胞的体积比为1:10；酶切正确的重组质粒和BL21感受态细胞体积比为1:50，BL21感受态细胞为BL21( DE3)感受态细胞。

5.根据权利要求1所诉的一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法，其特征在于：步骤（4）中LB培养基中含有氨苄青霉素，氨苄青霉素在培养基中的浓度为100 μg/mL；IPTG工作浓度为300μg/mL。