[发明专利]一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品分析技术领域，涉及一种食物过敏原及其致敏性残基含量的检测方法。

背景技术

牛乳是人们日常生活中经常摄入的营养物质，同时牛乳作为八大类过敏食物之一，牛乳过敏在人群中的发病率为0.3%～7.5%，而在儿童中的发病率达0.1～7.5%。美国食品药品管理局（FDA）规定食品标签中必须列出各类致敏成分，其中就包括牛乳及乳制品。食物过敏原的检测是食物过敏管理的关键环节，以便对过敏食物进行风险评估、生产和标示。牛乳中过敏原成分复杂，其中β-乳球蛋白约占牛乳蛋白含量的10%，约占乳清蛋白总量的50%，且IgE介导的牛奶过敏中82%的病人是对β-乳球蛋白过敏。因此，开展β-乳球蛋白的检测，是保护牛乳过敏人群合法权益的关键举措，也有利于生产低致敏食品，从而提高牛乳过敏患者的生活质量。

目前，食物过敏原的检测技术有免疫学技术、聚合酶链式反应技术、高效液相色谱技术、液相/质谱联用技术等，其中免疫学技术最成熟、最常用。抗体在免疫学方法检测食物过敏原中起着关键作用。抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，其中单克隆抗体只能识别一个表位，在检测过敏原肽段时存在明显不足，且抗体制备技术要求较高、价格昂贵，且一次性难以获得多株识别不同表位的细胞株。而多克隆抗体能识别多个表位，其制备方法简单、经济，能很好的弥补单克隆抗体在抗体制备及检测过敏原肽段方面的不足。

蛋白质的结构决定其功能，作为食物过敏原的蛋白，过敏原表位是引起过敏反应的物质基础，包括线性表位和构象性表位。食品在加工及工业应用中常常会经过加热、发酵、酶解等处理，这使过敏原构象性表位易被破坏，但线性表位则相对稳定，不易被破坏。利用表位疫苗原理，构建β-乳球蛋白IgE线性表位串联体，通过原核表达制备表位串联体蛋白，再根据免疫学方法制备β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体。通过基于β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体的ELISA方法可以检测食品中β-乳球蛋白及其致敏性表位肽段的含量，可评价食物样品致敏性的强弱，评估食品安全风险的高低，也为食品过敏原标示提供更可靠的检测方法。目前，在我国，利用过敏原IgE线性表位抗体对食品中过敏原的定量检测还是空白。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于IgE线性表位识别检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法。该方法准确、灵敏度高、特异性好、回收率高。

本发明是通过以下技术方案实现的。

1、β-乳球蛋白多克隆抗体的制备。

以牛乳β-乳球蛋白为抗原，通过常规方法获得β-乳球蛋白多克隆抗体。

2、β-乳球蛋白多克隆抗体的纯化。

首先，CNBr-Sepharose4B柱材与β-乳球蛋白偶联，制备免疫亲和柱。抗血清与等体积的PBS混合，将血清缓慢加入Sepharose4B亲和柱中，室温下孵育30min，再循环上样一次；用20倍柱体积的PBS进行非特异性洗脱，再用10倍柱体积的3MMgCl₂进行特异性洗脱得到β-乳球蛋白特异性多克隆抗体。纯化后，用截留分子量为3kDa的超滤管对抗体进行除盐，并浓缩至合适的体积。

3、β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体的制备。

表位疫苗是以抗原表位为基础制备的疫苗，由B细胞表位、T细胞表位及间隔序列组成。B细胞表位用来定向诱导宿主的体液免疫应答，而通过选择特异性的T细胞表位使机体的细胞免疫应答向特定类型定向发展，间隔序列具有保存表位独立的免疫原性，同时避免产生新的表位。

基于表位疫苗设计原理，以β-乳球蛋白IgE线性表位（B：AA1~8、AA31~48、AA47~60、AA67~78、AA75~86、AA127~144和AA141~152）、T细胞表位（T：AA77~97）及间隔序列（KK与G）为基础。通过DNAStar软件对不同组合串联体的抗原性、表面可及性及亲水性进行分析，使每个表位的抗原性和亲水性大于0，同时表面可及性大于1；再利用网络服务器SOMPA对不同组合的串联体二级结构进行分析，使表位形成β转角和无规则卷曲结构。通过以上生物信息学方法对表位串联体的分析，最终得到的串联体组合为：T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4。再合成串联体基因，并通过原核表达制备出β-乳球蛋白表位串联体重组蛋白。最后，以串联体蛋白为抗原，通过常规方法获得β-乳球蛋白IgE线性表位串联体蛋白多克隆抗体。

4、β-乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体的生物素化。