[发明专利]一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法

说明书

一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法，本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种细菌介导侵染转化蒙古柳的方法。本发明的目的是为了解决现有技术中没有蒙古柳的遗传转化受体再生体系的建立方法，而提供了一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法。本发明利用农杆菌介导侵染转化外植体为叶片诱导的愈伤组织，共培养和筛选转化愈伤组织，并诱导分化抗性丛生芽，在生根培养培养基上再生成植株，GUS染色检测转化再生植株表明有35S启动下β‑半乳糖苷酶活性。证明通过本发明的方法实现了农杆菌介导侵染转化蒙古柳。本发明的农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法用于植物基因工程领域。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种细菌介导侵染转化蒙古柳的方法。

背景技术

蒙古柳(Salix mongolica)，杨柳科(Salicaceae)，柳属(Salix)，属种名定名：Salix mongolica f.sericea Chang.et Skv。松嫩苏打盐碱草甸草原上的乡土灌木树种，小枝细长，叶线形或线状披针形，长5-15厘米，宽5-9毫米，幼叶有绒毛，后无毛，表面绿色，背面苍白色，边缘有腺锯齿；叶柄长8-12毫米。花先叶开放，接近同时开放，无花序梗，基部常有3个小叶；雄花序长2-3厘米，粗2-3毫米；雄蕊2个完全合生，雌花序长2.5-3.0厘米，粗约4毫米；子房有毛，无柄，花柱无或极短，柱头头状；苞片同雄花。分布：黑龙江、吉林、辽宁、河北等省；蒙古，苏联也有。蒙古柳的粗蛋白的含量>15％，叶中赖氨酸含量在2％左右，接近草木犀和苜蓿的水平，这一特点表明可以作为木本饲料，也是青黄不接的冬春两季草本饲料缺陷时的重要补充。

植物遗传转化的基础是相应外植体的离体再生，只有高频的外植体离体再生系统，才能建立高效率的遗传转化体系。自从1985年Horsh等人首创了农杆菌叶盘转化法，大大推动了农杆菌介导转化方法的应用，并促使植物遗传转化的研究得到了迅速发展，而且已成为现在广为应用的首选方法之一。目前国内外已有关于树木组织培养及离体再生方面相关报道，自从Parson等于1986年证实杨树可以进行遗传转化和外源基因在林木细胞中表达以来，林木基因工程研究已经取得很大进展。现已对杨树、火炬松、花旗松、白云杉、桤木、刺槐、麻栎、桉树、欧洲赤松、兰伯氏松、挪威云杉等20多个树种进行了转化研究。还有金丝垂柳J1010和旱柳建立了农杆菌侵染介导的遗传转化体系，并通过GUS组织化学染色转基因愈伤组织进行了初步检测。但是，仍未见蒙古柳的遗传转化受体再生体系建立的报道。基因工程的发展和应用为林木育种开辟了一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中没有蒙古柳的遗传转化受体再生体系的建立方法，而提供了一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法。

本发明利用农杆菌介导侵染转化外植体为叶片诱导愈伤组织，共培养和筛选转化愈伤组织，并诱导分化抗性丛生芽，在生根培养培养基上再生成植株，GUS染色检测转化再生植株表明有35S启动下β-半乳糖苷酶活性。

本发明的农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法按如下步骤进行：

一、人工培育蒙古柳无菌苗的叶片愈伤组织的诱导：蒙古柳种子用体积分数为69％～71％的酒精和体积分数为2％～4％的次氯酸钠消毒、灭菌后，在1/2MS培养基上发芽后，生长到4叶期或5叶期的无菌苗，剪取无菌苗长×宽为(0.5cm±0.1cm)×(0.5cm±0.1cm)的叶片在MSYD1培养基上诱导愈伤组织；27.5℃～28.5℃条件下，先光照条件下培养14h，再暗条件下培养10h，这样光暗条件交替培养20～25天，然后更换一次培养基，60～65天诱导出愈伤组织；