[发明专利]一种检测大鼠印记miRNA-483表达水平的引物

说明书

技术领域

本发明属于检测分析领域，具体涉及实时荧光定量PCR检测大鼠印记miRNA-483表达水平的引物。

背景技术

印记microRNA(miRNA)是一类与印记基因相互调控的长度为21～23nt内源性单链RNA分子，是近年来在表遗传领域中研究较多的“明星分子”。多研究发现，印记miRNA广泛参与细胞活动的一系列生理及病理活动过程，包括细胞发育、细胞调亡、细胞代谢、肿瘤形成、病毒感染及免疫应答等，印记miRNA更与男性生殖关系密切，对印记miRNA的研究不仅可为揭示男性不育发生机制提供重要依据，而且还可提供有效的预测标记。

印记miRNA-483是印记基因Igf2第7内含子区域编码的一条miRNA，它可影响印记基因Igf2甲基化从而反馈抑制Igf2基因的表达，并通过印记基因改变影响精子发生。大量研究显示，少、弱精子症男性精子细胞印记基因Igf2印记控制区域低甲基化，印记miRNA-483表达异常，故其被认为是一个候选的印记miRNA。

目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微阵列芯片，聚合酶链式反应(PCR)等。

1)Northern印迹分析当前miRNA分析的标准方法，但其操作繁琐耗时长，灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，容易污染，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。

2)芯片技术可实现高通量，多组分同时检测，但其检测费用高，芯片上可利用的样品体积很小，灵敏度和选择性较低。

3)实时荧光定量PCRSYBRGreen是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，变性DNA双链分开则无荧光，只有和双链DNA结合后才发荧光。SYBRGreen可以用于不同的模板，使用方便，价格相对便宜，灵敏度很高。缺点是可产生非特异性结合，因此在实验中必须做融解曲线，选择良好的引物并优化反应条件。开发简单直接，灵敏度高，特异性强，适用范围广，检测成本低，结果准确可靠的miRNAs分析技术仍然是一个挑战。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测大鼠印记miRNA-483表达水平的引物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测大鼠印记miRNA-483表达水平的引物，序列为5′-GCGCCCACTCCTCCCCTCCCGTCTTG-3′。

进一步地，所述引物的PCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性3s，60℃退火和延伸30s，进行45次循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明在p,p’-DDE暴露大鼠中筛查印记miRNA-483的表达，并针对该序列设计实时荧光定量PCR引物进行快速准确的定量检测。方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、适用范围广、成本低等优点，可进行高通量检测，是一种简便实用的分析技术。

附图说明

图1为印记miR-483与其宿主基因Igf2关系图；

图2为p,p’-DDE暴露后精子细胞印记基因Igf2甲基化水平下调图；

图3为退火温度为56℃的PCR反应融解曲线图；

图4为退火温度为58℃的PCR反应融解曲线图；

图5为退火温度为60℃的PCR反应的融解曲线图；

图6为退火温度为62℃的PCR反应的融解曲线图；

图7为p,p’-DDE对精子细胞microRNA-483表达改变图。

具体实施方式

本发明提供了一种引物，用于检测大鼠印记miRNA-483表达水平，检测原理是通过碱基堆积杂交作用，将microRNA引物与miRNAcDNA扩增模板结合，在DNA聚合酶作用下延伸引物引发PCR反应，得到双链DNA，通过实时测定染料SYBRGreenI与双链DNA结合产生的荧光信号，检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，比较循环阈值法(2^－△△Ct法)对起始模板进行相对定量分析。其中，所述引物的序列如SEQIDNO.1所示，所述RNA模板扩增序列如SEQIDNO.2所示：

SEQIDNO.1：5′-GCGCCCACTCCTCCCCTCCCGTCTTG-3′；

SEQIDNO.2：5′-GCGCCCACUCCUCCCCUCCCGUCUUG-3′。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

1、特异性位点分析