[发明专利]一种用于检测前列腺癌的引物和探针的组合及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种用于前列腺癌诊断的引物和探针。

背景技术

前列腺癌多发于老年男性，发病率在全球男性恶性肿瘤中占第二位，因癌症死亡的男性中，前列腺癌排名第五。年龄、性活动、饮食习惯和家族遗传为前列腺癌发病的主要风险因素。

2012年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为9.92/10万，且发病率逐年上升，并呈年轻化趋势。由于前列腺癌早期没有特异性症状，我国约70％前列腺癌患者发现时已是晚期。因前列腺癌骨转移率较高，自然进展的前列腺癌在利用有效方法临床检测到时通常已经转移。前列腺癌可以通过手术等切除前列腺、睾丸进行治疗，在切除之后由于没有肿瘤组织，检测体内是否还存在癌细胞的难度较大。

血管舒缓素相关肽酶3(kallikrein-related peptidase3，KLK3)，也被称作前列腺特异抗原(prostate-specific antigen，PSA)，KLK3基因是人类组织激肽释放酶基因(KLK)家族成员，位于19号染色体上，在前列腺癌组织中呈现高表达，其编码的蛋白是前列腺特异性抗原(PSA)。是临床上广泛用于筛选、诊断前列腺癌的肿瘤标志物。KLK3基因位于19q13.2-q13.4，基因全长6KB，含有5个外显子和4个内含子，转录后的mRNA全长1446bp，转录受雄激素调节。

目前，PSA检测、盆腔电子计算机断层扫描(CT)检查、盆腔核磁共振(MRI)检查、直肠超声(TRUS)引导下前列腺穿刺活检等检查是前列腺癌筛查的主要检测手段。对于PSA检测来说，患者血清中存在异常高水平PSA可能是由于癌症、良性前列腺增生或前列腺炎等多种原因导致，在大多数病例中，PSA升高是由于良性前列腺增生或前列腺炎而不是由于癌症；MRI检查在鉴别前列腺癌及伴钙化的前列腺炎、较大的良性前列腺增生、前列腺瘢痕、结核等病变时常无法明确诊断；盆腔CT对于早期前列腺癌的诊断敏感性低于MRI，前列腺癌患者进行CT检查的目的主要是协助临床医师进行肿瘤的临床分期；TRUS引导下的前列腺穿刺活检是目前公认的安全而准确的方法，已成为临床实践中诊断前列腺癌最可靠的检查，但是穿刺活检除了造成患者的创口疼痛外，其术后多种并发症也会给患者带来很大痛苦。

外周血循环肿瘤细胞(CTC)的检测是肿瘤患者液体活检的重要手段。当患者体内发生肿瘤时，或者肿瘤复发和转移产生时，瘤块组织中会有大量脱落的肿瘤细胞进入血液循环系统。利用高度灵敏的检测技术，将循环肿瘤细胞检测出来，可以对肿瘤进行早期诊断、复发和转移进行评估。

因此，建立新的前列腺癌诊断技术、能够在灵敏准确的确定患者体内是否存在前列腺癌细胞，以便对于诊断患者是否患有前列腺癌和判断患者手术效果来确定最佳治疗方案以提高患者存活率、降低医疗成本是十分必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测人前列腺癌循环肿瘤细胞的特异性引物和探针的组合及包括该引物和探针组合的试剂盒，以及他们的应用及检测方法。

本发明一方面提供一种人前列腺癌循环肿瘤细胞特异性基因检测的Real-time PCR引物和探针组合，用于人前列腺癌或其复发和转移的分子诊断，另一方面提供一种用于检测人前列腺癌循环肿瘤细胞的试剂盒，同时提供利用本发明的Real-time PCR检测试剂盒诊断前列腺癌的方法。

本发明通过在人前列腺癌循环肿瘤细胞基因组中KLK3基因的启动子区设计一对特异性的Real-time PCR引物和相应的探针，用该引物和探针对待测样本进行RT-qPCR检测，根据扩增结果判定待检样本是否含有人前列腺癌循环肿瘤细胞。

本发明提供的用于人前列腺癌循环肿瘤细胞检测的特异性引物和探针的组合，其具有如下序列：

引物1：5’ATCAGGAACAAAAGCGTGATCT 3’(SEQ ID NO.1所示)，

引物2：5’ATATCGTAGAGCGGGTGTGG 3’(SEQ ID NO.2所示)，

探针：5’ATTTCAGGTCAGCCACAGCT 3’(SEQ ID NO.3所示)。

本发明提供的用于检测人前列腺癌的Real-time PCR检测试剂盒，其特征在于包括以上所述的特异性引物和探针的组合。

优选的，在本发明中所述的试剂盒中还包括10×PCR缓冲液，50mM MgCl₂，10μM dNTP以及5U/μl Taq酶。