[发明专利]青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。所述青霉素扩环酶突变体的氨基酸序列以序列表中的SEQ ID NO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。本发明的青霉素扩环酶突变体具有提高的催化活性和耐热性，更适于商业和工业应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是临床使用最多和应用最广的一类抗生素。β-内酰胺环抗生素中最主要的两类是青霉素和头孢类抗生素。青霉素因其高效和低毒而成为临床上应用最广的重要抗生素。但是随着青霉素的大量使用，它的一些不足也暴露出来，如青霉素抗菌谱相对比较窄、容易导致病菌耐药性、对酸不稳定、不能口服等。

头孢菌素和青霉素都具有β-内酰胺特征，两者的不同之处是青霉素的母核由β-内酰胺环和五元噻唑环构成，而头孢菌素的母核则由β-内酰胺环和六元二氢噻嗪环构成。因此，头孢菌素不易被β-内酰胺酶(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的β-内酰胺酶)降解。而且头孢菌素具有高效、低毒、抗菌谱广、过敏反应少、可以口服、品种多等优点。头孢菌素作为一类广谱半合成抗生素，可分为以7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)为母核和以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为母核的两大系列。以7-ADCA为母核的系列是青霉素的下游产品。利用7-ADCA可以进一步合成头孢氨苄、头孢拉定等头孢菌素类抗生素药物。

目前，工业上从青霉素G到7-ADCA的合成使用化学法，反应条件苛刻，步骤繁琐，对环境造成污染。而使用青霉素扩环酶使青霉素G扩环从而得到G-7-ADCA(7-苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素)是更为有效和环保的方法。因此，青霉素扩环酶成为当今工业酶研究中的一大热点。但青霉素扩环酶的天然底物是不易廉价取得的青霉素N。非天然底物青霉素G则可以方便、廉价地获得。所以科学家们利用各种方法对青霉素扩环酶进行改造，以提高它对非天然性底物青霉素G的催化活性。自1976年Kohsaka首先对低等真核生物顶头孢菌的扩环酶进行研究以来，至今扩环酶的研究得到迅速发展。以棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)为来源的扩环酶由于具有潜在的工业应用价值而得到研究者的极大关注。然而，仍需要对青霉素G的催化活性和耐热性提高的青霉素扩环酶。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了青霉素扩环酶突变体、编码该突变体的DNA、含有该突变体的试剂盒及其应用。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种青霉素扩环酶突变体，其特征在于其氨基酸序列以序列表中的SEQ IDNO.:2为参考序列，具有位于第42位苏氨酸和第126位谷氨酰胺中的至少一者的突变，所述第42位苏氨酸突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者，所述第126位谷氨酰胺突变为除其自身以外其他天然氨基酸中的任一者。

(2)根据(1)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于其具有位于第42位苏氨酸的所述突变和位于第126位谷氨酰胺的所述突变。

(3)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为半胱氨酸、或天冬氨酸、或谷氨酸、或蛋氨酸、或脯氨酸、或谷氨酰胺、或精氨酸。

(4)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第42位苏氨酸突变为天冬氨酸。

(5)根据(1)或(2)所述的青霉素扩环酶突变体，其特征在于所述第126位谷氨酰胺突变为丙氨酸、或苯丙氨酸、或异亮氨酸、或亮氨酸、或蛋氨酸、或天冬酰胺、或色氨酸、或酪氨酸。