[发明专利]一种基于壳聚糖-石墨烯/金纳米颗粒复合膜的电化学DNA传感器的制备及应用的方法

说明书

本发明公开了一种利用金纳米颗粒(AuNPs)和壳聚糖(CTS)‑石墨烯(GR)复合膜修饰的离子液体碳糊电极(CILE)，以此为平台构建了一种新型电化学DNA传感器，并将其应用于金黄色葡萄球菌特征基因序列的测定。将离子液体1‑己基吡啶六氟磷酸盐与石墨粉以一定的比例混合制得CILE，探针ssDNA序列通过静电吸附固定在CTS‑GR/AuNPs/CILE上后与目标ssDNA序列杂交，以亚甲基蓝为指示剂来检测与目标序列的杂交反应。实验结果表明复合材料具有大的比表面积和良好的导电性，能够增加ssDNA探针的负载量，从而有效地提高电化学响应信号。

技术领域

本发明涉及一种新型纳米复合材料修饰电极的电化学DNA传感器的制备及应用的方法

背景技术

DNA电化学生物传感器是一种以ssDNA作为识别元件，通过DNA序列杂交进行分子识别的生物传感器，它能够将目标ssDNA序列的存在转变为可检测的电信号。与传统的标记基因检测技术相比较，DNA电化学生物传感器具有更为快速、简便、无污染等特点，并且避免了不能定量和受到污染导致假阳性的问题。此外DNA分子识别层十分稳定且易于再生，这使得DNA电化学生物传感器在基因分析领域发挥着重要的作用，被广泛应用于医学、食品工业、环境监测、药物研发等领域。电化学ssDNA传感器制备的主要步骤如下：(1)将探针ssDNA序列固定在电极表面；(2)与目标ssDNA序列进行杂交；(3)杂交反应的指示；(4)杂交信号的电化学检测。其中最为关键的步骤是探针ssDNA的固定和杂交反应的电化学检测，探针ssDNA在电极表面的固定量和杂交反应的检测方法会影响电化学传感器的灵敏度。

碳糊电极是利用导电性的石墨粉与憎水性的粘合剂混制成糊状物，然后填充在电极管中而制成的一类碳电极，它具有制备简单、价格便宜、选择性好、灵敏度高、电位适用范围宽及表面易于更新等优点，室温离子液体是指在室温及邻近温度下完全由阴阳离子组成的液体物质，具有电化学窗口宽、导电率高、热稳定性和化学稳定性好等优点。离子液体可以作为粘合剂与石墨粉混合制备离子液体修饰碳糊电极(CILE)，离子液体的存在能够有效地改变传统碳糊电极的性能，既可以增加碳糊电极的稳定性，又可以增加导电效率。

纳米材料具有比表面积大、生物兼容性好及导电性好等特点，常被应用于DNA电化学生物传感器的构建。金纳米粒子具有较好的导电能力，能够起到导线或者导电通道的作用，加速生物分子与电极间的电子转移，能够加快异相界面的电子传递速率。纳米金修饰电极可以增大电极的有效面积，用于制备DNA传感器时可以提高DNA固定量。

石墨烯(graphene,GR)是以sp²杂化连接的新型二维单层碳原子层晶体，其独特的二维结构可以作为生物分子和纳米材料的负载体。由于它具有电化学窗口宽、稳定性高、比表面积大、电催化活性高、导电性好等优点，在电化学传感器有着重要的应用前景。

壳聚糖是一种大量存在于自然界的天然高分子，具有无毒、成膜能力强、生物相容性好、高强度、高附着能力等优点，其表面大量氨基的存在能够与DNA分子发生静电吸附作用，而被大量用于制备电化学DNA生物传感器。

电化学沉积法是在含有要沉积离子的溶液中，通过改变电化学条件，如改变电位或者沉积时间将要沉积离子均匀的沉积在阴极或者阳极模板上。电化学沉积法有以下优点如：常温下就可以发生反应，反应温度低；通过监控转移的电荷数可以控制沉积薄膜的厚度；其组成和缺陷可以控制；可以在各种复杂形状的基底上沉积薄膜；可以进行非平衡相的沉积；驱动力可以进行精确的控制；耗费小等优点。电化学沉积法根据沉积电压和电流方式的不同，可以分为恒流电沉积法，恒压电沉积法，脉冲电沉积法，循环伏安法等。

金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，它是一种重要的致病微生物，由金黄色葡萄球菌感染可引起多种疾病，包括食物中毒、假膜性肠炎、烫伤皮肤综合症、毒素休克综合症、化脓性炎症和败血症等，会给人类健康造成了极大的威胁和损失。目前金黄色葡萄球菌的检测方法大致包括传统的细菌培养方法及生化鉴定、免疫学方法、荧光定量PCR法、荧光原位杂交法(FISH)以及基因芯片法等。