[发明专利]一种水貂绿脓杆菌灭活疫苗

说明书

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种水貂绿脓杆菌灭活疫苗。

背景技术

水貂出血性肺炎又称水貂假单胞菌性肺炎，是主要发生在每年8-11月份水貂换毛季节的一种急性传染病，以出血性肺炎、急性死亡为特征，死前出现呼吸困难、鼻孔流出红色带泡沫液体等症状，死后剖检可见整个肺叶肿大并有弥漫性出血和败血症变化。本病世界各地均有发生，每年可造成养殖场20％-40％的死亡率，是危害毛皮动物养殖业的重要细菌性传染病。

该病病原为假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)中的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginolsa)，亦称为绿脓杆菌(Bacteriumpyocyaneum)，为革兰氏阴性杆菌，两端钝圆，一端有一根鞭毛，能运动。不能形成芽孢及荚膜。在普通琼脂培养基上生长良好，形成大小不一的菌落。多数能产生色素，使菌落周围琼脂培养基着色。绿脓杆菌共有A、B、C、D、E、F、G、H、I、G、K、L、M、N等14个血清型。我国各地水貂出血性肺炎的流行血清型主要以G(6型)、B(2、5、16型)为主(括号内为对应的国际血清分型系统IATS)。

水貂出血性肺炎发病急，死亡快，发病时往往来不及治疗，常用药物替米考星、阿奇霉素、卡那霉素治疗效果不显著，而且抗生素的滥用导致绿脓杆菌已产生耐药性，因此需要有效的疫苗来预防，国外有报道将细菌细胞壁提取物(JAMESE.PENNINGTON，1979)加类毒素成分弹性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制备过程复杂，成本高，不适合大量生产使用，而且免疫次数多，免疫期短，不适合临床应用，绿脓杆菌抗原型繁多，单一成分的细胞提取物往往很难达到很好的保护效果。目前各国在水貂出血性肺炎的预防中多以菌体灭活疫苗产品为主，将流行血清型的菌株灭活后制备成多价灭活疫苗，可有效预防同类血清型菌株引起的该病。

发明内容

本发明的目的是提供一种水貂绿脓杆菌灭活疫苗，从而解决水貂绿脓杆菌灭活疫苗研发中现有疫苗株免疫原性不强、各血清型之间免疫交叉保护力低的问题。

本发明的一种水貂绿脓杆菌灭活疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其中使用的抗原为B型水貂绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginlsa)LN03株，该菌株于2016年2月22日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2016068。

上述的水貂绿脓杆菌是用甲醛进行灭活的；

优选佐剂为蜂胶佐剂或水佐剂；

所述的疫苗中含菌量≥4.0×10⁹CFU/mL。

本发明制备的灭活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保护，免疫后能够产生较强免疫力，接种貂群的发病率和死亡率均明显减少，能够有效预防水貂出血性肺炎的流行和传播，降低本病对毛皮动物养殖业造成的经济损失，有着广阔的应用前景。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。

本发明具体实施例所使用的培养基如下：

生产用培养基：

十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基(NAC)配制：称取4gNAC粉末加入100mL蒸馏水中，充分混匀后，121℃灭菌15min，冷却至50℃～60℃时，倾倒平板备用。

改良营养普通肉汤培养基(NB)配制：称取5gNB粉末加入100mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。临用前加入终浓度2％胎牛血清的营养肉汤培养基，混合均匀后配制而成。

发酵培养基配制：蛋白胨2％，牛肉膏0.6％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，用去离子水配成，配完调pH值7.4～7.6，112℃30min，灭菌后按照培养基的2％加入健康胎牛血清。

实施例1：

1.1绿脓杆菌菌株的分离纯化方法

从辽宁省疑似水貂出血性肺炎的某大型水貂养猪场选取发病水貂，无菌采集病貂的肺脏、肝脏和心血划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基(NAC)上，置于37℃培养箱培养16h～18h，挑取圆形、光滑、湿润、扁平的菌落革兰氏染色镜检，选取革兰氏阴性细小杆菌进行划线纯培养。

将纯培养菌株分别划线接种于鲜血琼脂平板和NAC平板，37℃培养16h～18h，选取在十六烷三甲基溴化铵培养基上产生绿色荧光色素，在血琼脂培养基上产生β溶血的小菌落进行纯化培养。