[发明专利]一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻 保存的方法。

背景技术

近几年国内外在ACI研究中主要集中在树突状细胞(DendriticCell， DC)、细胞因子诱导自然杀伤细胞(Cytokine-InducedNaturalKiller， CINK)、细胞因子诱导杀伤细胞(CytokineInducedKiller,CIK)、自然杀 伤细胞(NaturalKiller,NK)等抗肿瘤免疫效应细胞的诱导、扩增和回输。 临床获得免疫效应细胞源于患者或同属健康供者的外周血单核细胞 (PeripheralBloodMononuclearCell,PBMC)或骨髓细胞。由于PBMC比 骨髓细胞提取方便，患者接收度高，临床上以PBMC作为主要细胞来源。

临床上获取PBMC有两种方式，一种是采集静脉血50ml左右，通过梯 度密度法分离获得；另一种是通过血细胞分离机获得。由于患者个体差异， 有的需要多次循环收集才能达到实验要求的细胞数，采集时间长，病人痛 苦大，且产生较大的细胞总体积，至少50ml以上，需要添加更多的冷冻保 护剂，冻存和复苏流程也很复杂，且需占用更大的储存空间。机采PBMC与 手工分离提取PBMC相比，购置仪器投入的成本和患者使用的成本均较高， 每天接待的患者数量有限，特别是仪器发生故障时PBMC的采集工作就必须 中止，严重影响患者的治疗，因此机采PBMC后进行冷冻保存对医患双方并 非是一个经济实用的方案。

有鉴于此，急需设计一种经济实用、操作简便、高活性和高复苏率的 PBMC获取方法，以获得免疫效应细胞。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是设计一种经济实用、操作简便、高活性 和高复苏率的PBMC获取方法，以获得免疫效应细胞。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种体外人 工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法，包括以下步骤：

A1、对淋巴细胞进行分离：

抽取10ml静脉血注入EDTA抗凝真空采血管，待血液与抗凝剂混合均 匀后，在3000rpm和室温下离心10分钟；

用第一塑料巴氏吸管吸取血样中上层淡黄色血浆作为自体血浆，然后 在EDTA抗凝真空采血管中加入1:1的特定培养液稀释血样；

取15ml的第一锥形离心管加入5mlFicoll-PaquePlus溶液，再将稀 释后的血样加在Ficoll-PaquePlus溶液上面,在400g加速度和室温下离 心30分钟；

用第二塑料巴氏吸管吸取第一锥形离心管中两层液体间的不透明细胞 层，获得淋巴细胞，转入第二锥形离心管；

在第二锥形离心管中加入4℃预冷的特定培养液，与淋巴细胞充分混 合，250g加速度下离心10分钟；

弃上清，重悬第二锥形离心管中的淋巴细胞于4℃预冷的特定培养液 中，重复洗涤两次，留取细胞悬液获得纯化的淋巴细胞；

A2、对纯化的淋巴细胞进行冷冻保存：

将第二锥形离心管中纯化的淋巴细胞重悬于3ml含10％DMSO和30％自体 血浆的冷冻保存液中；

将淋巴细胞转入冻存管中，4℃平衡10分钟，然后按照1℃/分钟的降 温速度进行降温，最后保存在-150℃的气态液氮罐中。

在上述技术方案中，计算活细胞百分率和淋巴细胞回收率的方法如下：

依次在1、3、6、12、24、60个月后复苏冻存的淋巴细胞，取出冻存 管，迅速投入37℃水浴中，使冻存的淋巴细胞完全融解；

将冻存管中融解的淋巴细胞加入含10％FBS的完全培养基中，离心，弃 上清，重悬淋巴细胞于4℃预冷的特定培养液中；

从复苏后得到的PBMS细胞混悬液中取出10μl淋巴细胞悬液，并在淋 巴细胞悬液中加入0.4％台盼蓝染色液10μl；

3-5分钟后，取10μl淋巴细胞悬液与台盼蓝染色液的混合液加入到血 细胞计数板，置显微镜下观察；

根据正常细胞体完整、透明不着色以及死细胞呈蓝色的原理，随机计 数200个淋巴细胞，并计算活细胞百分率和淋巴细胞回收率。

在上述技术方案中，取冷冻保存处理前的细胞悬液进行细菌和真菌培 养。

在上述技术方案中，以均数±标准差表示计算结果，采用SPSS13.0统 计学软件分析数据。