[发明专利]一种用NsiI鉴定人乳腺癌BRCA1基因rs8176318多态性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用NsiI鉴定人乳腺癌BRCA1基因rs8176318多 态性的方法。

背景技术

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,包括剪辑的置换/插入和缺失等形式。 SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种,现已广泛用于简单和复杂疾病的遗传连锁分析/ 关联分析及疾病易感基因的定位,指导易感基因克隆.较常见的单碱基多态性位点的检测 方法包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),三引物等位基因扩增 法(TP-PCR)和测序等方法。这些方法虽各有优点,但也各有其不足之处。

PCR-RFLP是一种快速,简便,准确的检测SNP基因型的经典方法。其原理是:限制性 内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4-6bp),并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的 特异性意味着对特定等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的置换，插入和 缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切后产生片段的大小和数目。这些酶 切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶 位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。改方法的优点在于快速简单，终点判 断准确。但其主要缺点在于酶切位点的选择，要求待测多态性位点和某一酶切位点相关。 PCR-RFLP酶的选择具有局限性，并不是所有的SNP位点都可以用这种方法来鉴别，且部分内 切酶价格昂贵，实验成本高。三引物等位基因扩增法(TP-PCR)一种不需要限制性内切酶和 连接酶的重组DNA方法。反应体系中有2种模板和3种引物,从而在同一个反应体系中产生一 个重组DNA分子。这种方法的主要优点是快速，不依赖连接片段的限制酶位点。但其缺点是 扩增效率低，扩增特异性差，无法保证PCR产物的特异性和稳定性，分型结果易造成误判。 Taqman荧光探针法是一种新型高效准确的基因分型方法，其优点是检测灵敏度高，分型准 确。但该方法需要昂贵的仪器和较长的步骤,成本较高。

乳腺癌1号基因(breastcancer1，BRCA1)位于人类染色体17q21。BRCA1编码一种 核蛋白，在维持基因组稳定性中起作用。其编码的蛋白质与其他肿瘤抑制基因、DNA损伤传 感器及信号转导形成一个大的多亚基蛋白复合物称为BRCA1相关的基因组监控复合体 (BASC)。该基因产物与RNA聚合酶II关系密切，并通过C端结构域，与组蛋白去乙酰化酶复合 物的相互作用。BRCA1蛋白因此在转录、双链断裂的核酸修复和重组中发挥了重要作用。另 外有发明表明，BRCA1和BRCA2是两个最重要的乳腺癌抑癌基因，若其发生基因突变将导致 DNA损伤修复能力降低，突变长期积累为细胞发生癌变、肿瘤发生和发展奠定了基础。目前 BRCA1已经被证实是乳腺癌遗传易感基因,与家族性乳腺癌密切相关,其基因突变可以常染 色体显性遗传方式传递给子代。BRCA1基因突变的携带者一生中患乳腺癌,卵巢癌危险显著 增加,到70岁时发生乳腺癌的预测累积风险可达到大约80％，同时容易早年发病。

BRCA1基因rs8176318位点多态性在人群中存在三种基因型：GG型(人基因组 rs8176318多态位点的两个等位基因碱基均为G)，GT型(人基因组rs8176318多态位点的两 个等位基因碱基分别为G和T)和TT型(人基因组rs8176318多态位点的两个等位基因碱基均 为T)(美国国立卫生发明院国立医学图书馆生物信息技术中心，http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)。

目前人BRCA1基因多态rs8176318的鉴定常采用PCR-RFLP方法。但是目前鉴定人 BRCA1基因多态rs8176318时常使用的限制性内切酶价格昂贵(关于部分内切酶的参考价格 可参考后面的表1)，实验成本高，难以在实验室中普及使用。

因此，本领域存在对操作简单，成本低，使用范围广的新型检测SNP方法的需求。本 领域迫切需要在节约实验成本的前提下，通过PCR-RFLP技术的改进，来开发经济、快速的检 测人BRCA1rs8176318基因多态性的试剂盒。

发明内容