[发明专利]一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)粗酶制备：淡紫拟青霉YT08发酵液经10000r/min离心5min，去除 菌体后收集保留上清液，然后再经微孔过滤膜过滤除淡紫拟青霉YT08菌体， 即为粗酶液；

(2)淡紫拟青霉壳聚糖酶纯化：在步骤(1)获得的粗酶液中加入固体硫 酸铵至30％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置5～10h后，离心去除杂蛋白，并收集 上清液；离心去杂蛋白后的上清液上再加入固体硫酸铵至80％的饱和度，4℃冰 箱冷藏静置过夜，离心，收集沉淀；用pH5.0的0.2mol/LHAc-NaAc缓冲液 溶解沉淀，在透析袋中透析除盐，透析后的酶液经PEG4000浓缩后经Sephadex G-100柱层析纯化，用0.2mol/LpH5.0HAc-NaAc缓冲液洗脱，流速在0.5～1 mL/min；检测每管酶液的酶活力和蛋白含量，合并酶峰部分的酶液，最后经 PEG4000浓缩，即得纯化后的淡紫拟青霉壳聚糖酶，冷冻干燥后制得固态淡紫 拟青霉壳聚糖酶。

2.根据权利要求1所述的一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于 淡紫拟青霉壳聚糖酶粗酶液的制备方法：

(1)菌种活化：取保存淡紫拟青霉YT08菌种接种于活化培养基中，在 28℃、200rpm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液；

(2)发酵生产壳聚糖酶：按照0.2～0.8％(v/v)的接种量在灭菌后的发 酵培养基中接入步骤(1)活化种子液，在180rpm的旋转摇床中培养，控制温 度为30～34℃，发酵3-5d后培养完毕，发酵液经离心过滤除菌后直接作为壳 聚糖酶液使用；或者在发酵罐中以70％的体积比例装入发酵培养基，经118℃ 蒸汽灭菌20min后，按照0.2～0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，控制发酵 过程中的pH始终维持在pH5～6.5，调节培养温度在30～34℃，溶解氧维持 在10％(mg/ml)以上，经发酵2-4d后发酵完毕，经离心过滤除菌后直接作为 壳聚糖酶液使用。

3.一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的活化培养基 (g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH7.0，121℃灭 菌20min备用。

4.一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基 (g/L)：甘油10～20，大豆蛋白胨20～35，MnSO₄0.5～2.5，脱乙酰度85％以 上的粉末壳聚糖12～20，NaCl2.5～4，CaCl₂0.5～1.5，MgSO₄1.5～3.5， FeSO₄0.5～2，pH5～6.5。