[发明专利]用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法

权利要求书

1.用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，其特征在于，是将奶牛乳腺组织预处理后采用培养瓶侧置法静置贴壁培养30min，再配合组织块回收法进行分离培养，最后采用差时胰酶消化法配合瓶内消化法纯化获得纯化的奶牛乳腺上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，其特征在于，所述奶牛乳腺组织为已达到性成熟、无泌乳史的奶牛的乳腺组织的中部。

3.根据权利要求1所述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，其特征在于，所述奶牛乳腺组织的预处理方法为：取奶牛乳腺中部组织置于75%的酒精中浸泡3min，用无菌生理盐水浸洗3～4次去除酒精；无菌操作剔除乳腺组织外部泛白的组织、脂肪组织和结缔组织，即得到乳腺上皮细胞的实质组织，然后用D-Hank′s液冲洗3～4次后放入装有适量D-Hank′s液的烧杯中，将实质组织剪成1mm³的小块；用D-Hank′s液将剪碎的小块实质组织清洗干净，弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5mL枪头吸取组织块糊状物；将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布，采用培养瓶侧置法静置贴壁培养30min。

4.根据权利要求1所述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，其特征在于，所述组织块回收法的操作过程为：取出权利要求3所述的侧置法静置贴壁培养30min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入完全培养液，覆没组织块，放入二氧化碳培养箱中37℃、5%CO₂培养，培养液变黄时及时更换新鲜培养液；待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液。

5.根据权利要求4所述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，其特征在于，所述完全培养液的制备方法为：在DMEM/F12基础培养液中按体积比5:1的比例加入胎牛血清FBS，然后加入抑菌药物，其中青霉素的含量为500U/mL，链霉素的含量为500U/mL，两性霉素B的含量为5μg/mL。

6.根据权利要求1所述的用于奶牛乳腺上皮细胞原代培养的细胞体外培养方法，其特征在于，所述差时胰酶消化法配合瓶内消化法纯化奶牛乳腺上皮细胞的具体操作过程为：差时胰酶消化法，将权利要求4得到的细胞弃去培养液，经D-Hank’s清洗后，加入1mL胰酶消化液，消化30～60s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，待成纤维细胞收缩变圆浮起，乳腺上皮细胞已有收缩但未浮起时，立即加入2mL完全培养液终止消化，轻轻晃动后弃去完全培养液，加入4mLD-Hank’s液，轻轻洗除残余的成纤维细胞，加入完全培养液在细胞培养箱中37℃、5%CO₂培养；瓶内消化法，是在差时胰酶消化法纯化奶牛乳腺上皮细胞的过程中，进行瓶内消化平铺：加入4mLD-Hank’s液，清洗后，加入1mL消化液，消化2～3.5min后，弃去600μL消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再加入4mL完全培养液终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞，利于培养。