[发明专利]一种茶树花原生质体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种茶树花原生质体及其制备方法和应用。

背景技术

茶叶是中国乃至世界的主要饮料，其之所以能成为中国人千百年以来筛选出来的主要饮 品，成为生活七件事之一，是因为茶叶中含有多种功能成分，可以促进人体代谢活力、提高 免疫力、生津活血、凝神静思，现代科学又发现其具有抗癌、抗炎、降血糖、降血脂等诸多 功效。茶叶具有如此之多的功效物质，但目前对其研究尚浅，这些物质的代谢及其调控机制 仍不明确，这一方面是有由于这些物质是茶叶中特有的物质，没有模式植物可以借鉴，另一 方面，也正是由于该物种的特异性，想要确定某个蛋白基因的功能，没有很好的表达体系去 验证，很多机制由于拟南芥或烟草中没有相关的代谢通路，无法得到验证；而且茶叶是木本 植物，其转基因技术和组培技术的发展也颇具难度，因此，开发茶树原生质体分离和表达的 技术，是一个重要的突破方向。目前有一些木本植物叶子的原生质体分离技术可以借鉴，如 苹果、橙子等，然而茶树的叶子由于纤维素和多酚等含量高，难以得到大量状态好的原生质 体用于后期转化表达实验。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中做茶树基因功能验证的手段匮乏，提供一种高效分离茶 树花原生质体的方法以及该方法制备得到的茶树花原生质体和该茶树花原生质体在外源基因 的表达应用。

本发明人研究发现，与其他植物相比，茶树(Camelliasinensis)的叶子由于高纤维、高多 酚含量，难以获取高质量、大数量的原生质体，茶树花作为废弃资源，具有跟茶叶一致的遗 传背景，而且花的组织比较嫩，容易分离，茶树花的原生质体则能获得很好的分离效果和表 达活性。

本发明的茶树花原生质体，是将茶树花置于消化酶液中经酶解消化后得到茶树花原生质 体。

优选，所述的消化酶液具体配方为：每10ml含有MES0.039g、甘露醇1.6g、KCl0.0149g、 纤维素酶0.15g、离析酶0.04g、果胶酶0.01g和CaCl₂0.0148g，余量为水。

优选，具体步骤如下：将茶树花弄成细条后，放置于消化酶液中，于黑暗25℃下摇晃 酶解消化得到茶树花原生质体。

本发明还提供了上述茶树花原生质体在将外源基因转入该茶树花原生质体进行表达的 应用。

本发明通过调整消化酶液配方体系，可以将茶树花100％彻底降解，并获得大量未破损的 茶树花原生质体。同时，外源基因转化茶树花原生质体后得到的表达率可达30％以上，与模 式植物拟南芥中的平均表达水平一致。本发明对今后茶树基因功能验证乃至亚细胞定位以及 代谢产物检测提供了更直接的证据，比在拟南芥和烟草等模式植物中验证更有针对性；而且， 与长达一周以上的农杆菌注射烟草或组培茶苗的瞬时表达实验相比，该方法所需的设备材料 简单，且快速有效，两天即可看到实验结果。而茶树花原生质体的分离也为其进一步综合利 用奠定了一定的基础，还可以对茶树花废弃资源的深加工利用奠定一定的基础。

附图说明：

图1是在血球计数板上观察的经消化酶液消化分离后的茶树花原生质体，一个个透明的圆形 细胞即为茶树花原生质体。

图2是在倒置荧光显微镜中观察的经eGFP::pUC18转化后的茶树花原生质体，图中A、C是 明场，分别是在10倍和20倍的放大倍数下；B、D是对应的GFP通道，其中的亮点是大量 表达了绿色荧光蛋白GFP的茶树花原生质体。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

申请人研究发现，与其他植物相比、并经过一定的条件优化，茶树花的原生质体能获得 很好的分离效果和外源基因表达活性。

以下对实施例的具体步骤进行说明：

a)茶树花原生质体的分离纯化：