[发明专利]一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪轮状病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠病毒科，轮状病毒属，为双股正链RNA，分为A、B、C、D、E和F6个群，在发生腹泻的动物中最常见的是A群，感染猪的RV有A群、B群、C群和E群。RV于1968年由美国的MebusMS等首次从犊牛粪便中分离成功，后来发现其可用非洲绿猴肾原代细胞进行培养。ElAttarL等试验结果表明，在适宜的条件下，感染某种动物的轮状病毒会因一种致病的适应轮状病毒给其他不同种属动物带来感染隐患，例如在犊牛和猪、人和猪之间可交叉感染。该病主要以厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征，对人类健康和畜牧业发展都有较大危害。自1974年Woode等在英国首次报道猪的RV后，RV在猪群中的传播引起了许多国家的重视，接着澳大利亚、北爱尔兰、美国、法国等均有RV引起仔猪腹泻的报道。据报道，美国断奶仔猪感染阳性率为80%，病死率为15%，当有混合感染时，病死率更高。中国自1982年从腹泻猪粪便中分离到RV，证实猪RV感染在我国普遍存在。该病可以引起仔猪的死亡、成年猪的掉膘、饲料报酬的降低、增加人工费和药费的开支等，在猪病毒性腹泻中由RV造成的损失仅次于猪流行性腹泻病毒（TGEV），所以国内外非常重视的对RV的防制。

对猪轮状病毒的快速准确诊断，不仅有利于养殖场对该病做出正确的防制措施，而且有利于其他猪消化道疾病的防治以及防止该病毒在病畜和人之间的交叉传播。目前实验室诊断RV的方法大致可分为2类：①血清学方法，如ELISA方法、血清中和实验、免疫荧光等；②分子生物学方法。血清学方法存在假阳性过多的问题和现象，并且不适于RV急性感染的早期做出快速准确的诊断。分子生物学方法包括PCR、定量PCR、套式PCR，虽然PCR方法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，用时也较长，不适合基层和现场检测。

发明内容

本发明的目的是为了解决基层检测猪轮状病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪轮状病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪轮状病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；

其中：

F3CATCTGATTACATTGAGAATTGG

B3TGCATTAAAAGCACACGAAT

FIPAGTGAATGATGCTGAGTATGGAAGTTTTACAAAATAGACGACAGCGTA

BIPTAGATCACAGCCGGCACATGCAAATCCAGCCACCTGAA

LFGGCTTATGGAACACGAATCCAG

LBTTAATGGGGACTATGTGGATTAACG；

所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

以上所述的猪轮状病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪轮状病毒的RNA。

以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgSO₄15-20mM、(NH₄)₂SO₄15-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH为8.7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。

一种猪轮状病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测疑似猪轮状病毒病变组织、猪粪便排泄物或培养物中是否含有猪轮状病毒，具体检测步骤包括：

（1）RT-LAMP引物的设计与合成