[发明专利]一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液配方及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液配方及其制备方法，属于组织细胞培养技术领域。

背景技术

细胞冻存技术是细胞生物学技术中一个非常重要的手段，常规的细胞冻存液中，往往需要添加10％浓度的二甲基亚砜和人或动物源的血清或蛋白。随着近年来干细胞治疗技术和免疫细胞治疗技术的发展，细胞冻存液在临床上的使用的需求越来越大，冻存的细胞复苏后理论上需要洗涤，去除细胞冻存液中的二甲基亚砜和其它动物源的成分，但该过程在实验室操作起来简便，对于临床上的使用非常麻烦，往往二甲基亚砜被直接输入人体。国内临床使用的细胞冻存液中的二甲基亚砜往往使用的是国外进口的医药级试剂，价格非常昂贵，即使使用国外进口的高质量二甲基亚砜,在临床上依然有很多病人会出现严重的副反应。临床上对更为安全的细胞冻存液的需求非常迫切，我们在前面申报的专利，申请号为20151074667913，发明名称为《无蛋白液氮冻存液及其制备方法》基础上，对冻存液的配方做进一步的改进，实现在-80℃，使用无二甲基亚砜无蛋白的冻存液，可以达到高效率的细胞冻存和复苏。新的配方为冻存液在临床的使用带来了便利，可以避免由二甲基亚砜给病人带来的副作用，使用更为安全。

发明内容

本发明主要提供了一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液配方及其制备方法，该冻存液完全由化学成分组成配制，不含二甲基亚砜，细胞复苏率高，稳定性好。

本发明的技术方案如下：一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液，其每100mL的细胞冻存液中含有6.0g的右旋糖苷、1.0～9.0g的马来酰化的多聚赖氨酸，余量为RPMI-1640细胞基础培养基。

优选的，所述的马来酰化的多聚赖氨酸的修饰度为30～90％。

优选的，所述每100mL细胞冻存液中含有7.0g的60％修饰度的马来酰化多聚赖氨酸。

本发明的另一技术方案如下：一种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)称取配方量的右旋糖苷，溶解于70％量的RPMI-1640细胞基础培养基中；

(2)在上述溶液中添加配方量的60％修饰度的马来酰化多聚赖氨酸；

(3)最后添加剩余的RPMI-1640细胞基础培养基；

(4)在无菌条件下将上述混合液先用0.45μm滤膜进行澄清过滤，然后在无菌条件下再用0.22μm滤膜进行过滤除菌，即得到无二甲基亚砜无蛋白液氮细胞冻存液。

有益效果：

本发明的无二甲基亚砜无蛋白细胞冻存液，完全由化学成分组成配制，不含二甲基亚砜和蛋白质，细胞复苏率高，能达到90％以上；因不添加二甲基亚砜，冻存液用于临床上细胞的冻存，直接输入人体，可避免由二甲基亚砜引起的副作用、同时不添加人白蛋白、动物血清等，减少了细胞感染病原的可能性。将配好的细胞冻存液采用分级过滤的方法进行制备，避免高温消毒引起冻存液成分的破坏，被破坏的部分成分会导致细胞毒性。该冻存液的配方对细胞有极好冻存效果，同时因配方中避免使用价格昂贵的进口二甲基亚砜,生产成本更低，操作简化。

本发明的配方中一个成分是我们依据细胞冻存的原理，用有机合成的方法获得的高分子。然后在我们的无蛋白液氮冻存液配方基础上做进一步的改进和优化。本发明采用有机合成的方法，合成特定的酸酐修饰的多聚赖氨酸，然后和其它不同的高分子混合，得到合适的无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液。

这种无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液的使用方法之一，具体的为，取人淋巴细胞，用细胞洗涤液洗涤后，调整至每管中含有10⁶个细胞，离心去除洗涤液，每管中加入1ml无二甲基亚砜无蛋白-80℃细胞冻存液悬浮细胞，于-80℃在冰箱中直接冻存。