[发明专利]一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法及其应用在审
申请号: | 201610263702.8 | 申请日: | 2016-04-26 |
公开(公告)号: | CN107312770A | 公开(公告)日: | 2017-11-03 |
发明(设计)人: | 陈琰;郭飞飞 | 申请(专利权)人: | 厦门飞朔生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N15/10 | 分类号: | C12N15/10;C12Q1/68;C40B50/06 |
代理公司: | 厦门市首创君合专利事务所有限公司35204 | 代理人: | 张松亭,姜谧 |
地址: | 361100 福建省*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 用于 通量 检测 肿瘤 brca1 基因 变异 文库 构建 方法 及其 应用 | ||
技术领域
本发明具体涉及一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法及其应用。
背景技术
乳腺癌、卵巢癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤。不同国家女性乳腺癌的发病率显著不同,以美国和北欧发病率最高。乳腺癌的发生、发展与多种因素有关,是由环境因素和遗传因素共同作用的结果。BRCA1、BRCA2是Breast Cancer Susceptibility Gene 1、2的缩写,即乳腺癌易感基因1/2。其中,BRCA1基因定位于人类染色体17q21,由23个外显子构成;BRCA2基因定位于人类染色体13q12.3,由27个外显子构成。BRCA1、BRCA2基因同为抑癌基因,在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用。
数据表明,约2%的女性乳腺癌患者和10%-15%的卵巢癌患者存在BRCA1、BRCA2基因突变。BRCA1、BRCA2基因突变状态与家族性乳腺癌发病关系十分密切,基因突变表型往往具有诱发乳腺癌和卵巢癌的趋向。研究显示,BRCA1和BRCA2基因突变携带者是发生乳腺癌、卵巢癌的高危人群,其终生乳腺癌患病风险显著增加:突变携带者罹患乳腺癌的概率为40-80%,罹患卵巢癌的概率为16-60%(一般人群患癌风险分别为12%和1%)。BRCA2基因突变亦会造成男性乳癌(发生率6%)。
据乳腺癌信息中心(Breast Cancer Informationcore,BIC)报道,BRCA1、BRCA2基因突变已达到3000多种,这些突变分布于整个编码区,最常见的致病性突变为移码突变、无义突变等,没有明显的突变热点。大多突变导致截短蛋白的形成,使BRCA1、BRCA2蛋白质功能丧失,从而导致肿瘤发生。
BRCA1、BRCA2基因突变不存在高频率的突变热点,这意味着,基因测序不能只检测BRCA1、BRCA2基因某几个固定的位点,而是要进行全基因测序。本试剂盒对BRCA1/2基因全外显子进行扩增文库制备,于高通量测序仪上进行测序反应,可以快速地检测BRCA1/2基因编码区外显子的共计193个突变位点(点突变,小片段插入、缺少、重复),具体信息参见表1。通过检测BRCA1、BRCA2基因突变,可以反映乳腺癌的发生发展,也可筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群;通过对携带BRCA1、BRCA2 基因突变的高危人群进行严密的随访和监测,有助于乳腺癌的及早发现、及早诊断和及早治疗,从而获得更好的治疗效果。有报道指出,尚未患乳腺癌的女性BRCA基因突变携带者可通过干预措施(比如预防性乳腺切除术或服用他莫昔芬)、筛查或二者结合进行预防、以及辅助指导个体化用药。
现有的肿瘤基因检测主要采用荧光定量PCR法,检测通量低,对于BRCA1和BRCA2基因全外显子检测时,费用高及样本量需求大,导致临床收费高及样本量不足。而目前行业公认的基因突变检测金标准是Sanger测序法,这类技术操作复杂,通量较低,灵敏度低,具有一定的漏检风险,难以满足大量肿瘤患者的检测需求。因此,发展一种准确率高、通量大、安全的肿瘤BRCA1和BRCA2基因全外显子检测方法,是对现有肿瘤个体化诊疗的有效补充和完善。
高通量测序(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS),能够实现一次并行对几十万到几百万条目标核酸分子进行序列测定,具有高输出量与高解析度的特性,不仅提供了丰富的序列变异信息,而且使得测序的费用和时间大大缩短,迅速获得认可。在癌症多通路多靶标研究中发挥显著作用,凸显出这一全新技术手段的临床重要性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷,提供一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法。
本发明的另一目的在于提供基于上述构建方法的试剂盒。
本发明的具体技术方案如下:
一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法,覆盖人类BRCA1/2基因全部外显子区域突变,具体包括如下步骤:
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