[发明专利]骨髓增生异常综合征动物模型及转基因斑马鱼在制备该动物模型中的用途

说明书

本发明涉及一种转基因斑马鱼在制备骨髓增生异常综合症(MDS)的动物模型中的用途，其中所述转基因斑马鱼为c‑myb^hyper突变体。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体地，涉及斑马鱼用于人类白血病的发病机理研究及其大规模药物筛选的用途。

背景技术

很多调节因子都与正常造血细胞的增殖、分化以及谱系命运决定相关。原癌基因c-MYB是其中一种关键的调节因子(1，2)。c-MYB特异性表达在造血干细胞以及祖细胞中，并且其表达随着细胞分化而降低(2-4)。

骨髓增生异常综合症(MDS)是老年人常见的血液肿瘤疾病，并且可以进展为急性髓系白血病(AML)或者急性淋系白血病(ALL)(38)。然而，MDS进展为AML或者ALL的具体分子机制尚不清楚。其中获得型突变是MDS向急性白血病转化的一个重要因素(39)。

现有的一种c-MYB异常激活小鼠中，其c-Myb是在鼠的淋巴细胞特异性启动子下启动，而不是原有的启动子启动，其表达的时空已经发生改变。结果是，只影响到淋巴细胞的发育，导致淋巴细胞血液疾病，而对髓系细胞发育和髓系血液疾病的影响并无研究(42)。

斑马鱼与人的血液组成以及基因调控机制的相似使得斑马鱼成为研究造血发育的理想动物模型(19)。斑马鱼已经作为疾病模式动物用于阐述一些造血疾病的新的分子机制(20)和筛选新的药物(21)。通过突变或者过表达一些原癌基因建立起与血液肿瘤相关的越来越多的斑马鱼突变体和转基因系(22，23)。利用斑马鱼白血病模型不仅可以进一步研究人白血病发病的分子机制，还可以在体内进行新的小分子化合物的药筛。

斑马鱼是进行药物研发的理想模式动物(21，35)。斑马鱼相比于小鼠更适合做大规模的药物筛选，具有成本低、高效等优势。斑马鱼用于药物筛选可以实现以下益处：高通量：斑马鱼产卵数量多，且受精后的1天开始加药，2-5天后检测，在此期间卵黄可提供胚胎营养而不用喂食，使得可以用96孔或384孔板进行药物筛选。低费用：斑马鱼饲养和消耗的费用远远低于小鼠，平均每天每只消费约为小鼠的1/100。给药方便：可直接将化合物溶于水中，扩散至胚胎，所需化合物的量仅为小鼠的1/100-1/1000。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：c-myb转基因斑马鱼在表型、药物敏感性、疾病进展过程等方面与人的白血病具备何种程度的相似性？如何开展新的斑马鱼白血病模型的建立及标准化、高通量新药筛选？

为了解决这些技术问题，本发明人提出了以下发明总体构思：

(1)胚胎时期，利用标记不同阶段髓系细胞的探针进行WISH实验来检测详细的髓系造血改变，用c/ebpɑ标记不成熟的中性粒细胞；用lyz标记成熟的中性粒细胞；用mfap4来标记成熟的巨噬细胞。阐述c-myb在斑马鱼中特异性髓系祖细胞分化以及随后中性粒细胞和巨噬细胞命运选择中的作用。

(2)在成鱼时期，将c-myb异常激活斑马鱼和已经用dsRed标记了髓系祖细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的转基因家系鱼进行杂交，用流式细胞仪(FACS)和细胞学方法分析(3M，1Y)杂交子代的肾脏、血液循环系统中髓系细胞的数量、亚型、分化阶段的情况，观察白血病的特征是否会在这些鱼中出现。

(3)用Brdu、TUNEL实验确定髓系细胞分化过程中增殖和凋亡的改变。