[发明专利]一种TALE重复序列载体的构建方法

权利要求书

1.一种构建TALE重复序列载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

1）以含有TALE二聚体的核苷酸序列为模板进行PCR扩增；

2）以BsaI酶切步骤1）得到的扩增产物，将所述酶切获得的含TALE的片段连接形成TALEN重复序列载体；

其中，步骤1）中所述TALE二聚体的单体具有如SEQ ID NO:1所示的通式：

SEQ ID NO:1 LTPEQVVAIASX₁X₂GGKQALETVQRLLPVLCQX₃HG；

其中，X₁X₂选自NH、NI、HD和NG中的一个组合；X₃为A或D；其中，所述二聚体单体中的一个X₃为A，另一个X₃为D；

其中，步骤2）是通过包括下述步骤的方法实现的：

将步骤1）中得到的PCR回收片段、TALEN骨架载体、BsaI酶、DNA连接酶、CutSmart缓冲液、ATP混匀，置于PCR仪中反应；每一种PCR回收片段与TALEN骨架载体的质量比为1：10。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述单体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有TALE二聚体的序列是通过包含下述步骤的方法得到的：

首先，以包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列为模板，使用引物F9/R9和F10/R10分别用Q5DNA聚合酶PCR扩增得到第一个TALE单体和第二个TALE单体；然后使用引物F9/R10通过重叠PCR将所述第一个和第二个TALE单体拼接起来；其中，所述引物F9为SEQ ID NO:19； 引物R9为SEQ ID NO:20；引物F10为SEQ ID NO:21；引物R10为SEQ ID NO:22 。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR所使用的二聚体扩增引物选自下述组合中一组或多组：

以SEQ ID NO:3为上游引物，SEQ ID NO:4为下游引物；

以SEQ ID NO:5为上游引物，SEQ ID NO:6为下游引物；

以SEQ ID NO:7为上游引物，SEQ ID NO:8为下游引物；

以SEQ ID NO:9为上游引物，SEQ ID NO:10为下游引物；

以SEQ ID NO:11为上游引物，SEQ ID NO:12为下游引物；

以SEQ ID NO:13为上游引物，SEQ ID NO:14为下游引物；

以SEQ ID NO:15为上游引物，SEQ ID NO:16为下游引物；

或以SEQ ID NO:17为上游引物，SEQ ID NO:18为下游引物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，二聚体扩增的反应条件为：

98℃反应30秒，98℃反应10秒, 55℃反应10秒, 72℃反应20秒；30个循环后，72℃延伸2min, 产物于4℃保存。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述PCR反应条件为：37℃反应5分钟，20℃反应5分钟，20个循环；50℃反应5分钟，80℃反应5分钟。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TALEN骨架载体选自pTALEN-NI、pTALEN-NN、pTALEN-NG或pTALEN-HD。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4连接酶或T7连接酶。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR回收片段为多种不同的片段。

10.一种含有TALE二聚体的质粒，其特征在于，所述质粒是通过包括下述步骤的方法得到的：

首先，以SEQ ID NO:2为模板，使用引物F9/R9和F10/R10分别用Q5 DNA聚合酶PCR扩增得到第一个TALE单体和第二个TALE单体；然后使用引物F9/R10通过重叠PCR将所述第一个和第二个TALE单体拼接起来；然后，通过EcoRⅠ/BamHⅠ酶切，得到TALE二聚体单元；最后，将所述TALE二聚体单元克隆到pEGFP-N1载体中，即得；其中，所述引物F9为SEQ ID NO:19 ;引物R9为SEQ ID NO:20; 引物F10为SEQ ID NO:21 ；引物R10为SEQ ID NO:22。