[发明专利]HQO作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用

说明书

技术领域

本发明涉及HQO作为监测活细胞中线粒体自噬过程荧光探针的应用。

背景技术

线粒体是细胞内的发电站也是活性氧产生的主要部位，除了供给细胞能量之外也参与了很多其他的代谢过程，如钙离子的存储，通信及细胞分化，生长，凋亡和死亡。细胞内活性氧(ROS)量的增加会导致线粒体的氧化性损伤，同时，线粒体损伤的集聚又与细胞老化，癌症和神经变性疾病有关。因此，保持线粒体的健康数量对细胞存活是必不可少的。损伤的线粒体或者过量的线粒体会通过自我吞噬过程被有选择性的淘汰，以此保持线粒体的质量和数量。溶酶体是酸性的细胞器(pH 4.5-5.5)，负责废物的处理，它们能分解各种细胞废物，包括蛋白，核酸，糖类，脂类和细胞碎片。线粒体自噬是自我吞噬的一种，以此去除细胞内机能失调的线粒体并且依靠溶酶体方式进行成分循环。在线粒体自噬过程中，受损伤的线粒体被选择性的隔绝成自噬线粒体，然后自噬线粒体与附近的溶酶体融合，形成自噬溶酶体(包被线粒体的自吞噬泡)，在自噬溶酶体内线粒体的成分被分解。监测活细胞线粒体自噬发生过程的探针将为线粒体代谢提供深刻的见解，也将为筛选线粒体自噬抑制或者促进剂提供有力的工具。

大部分监测自噬过程的方法都是通过抗体或者荧光蛋白标记技术检测蛋白标志物。虽然这些方法能在分子层面检测线粒体自噬过程，但很少有蛋白标志物能高特定性反映线粒体自噬过程。此外，基于抗体的检测很难在活细胞内实施。线粒体或者溶酶体小分子荧光探针一起被用于探测线粒体自噬，如lysoTracker Red(LTR)and MitoTracker Green(MTG)16。基于荧光小分子的监测方法简单，但是监测时需要同时使用两种荧光染料分别染色线粒体和溶酶体。且溶酶体参与细胞内的吞噬作用，细胞内吞作用和自噬过程，溶酶体探针可以染色所有溶酶体，而不只是染色线粒体的自噬溶酶体。目前，并没有同时用于检测线粒体和溶酶体的荧光探针，也没有可检测包被线粒体的自噬溶酶体的荧光探针。

发明内容

本发明的目的是提供HQO作为监测线粒体自噬过程荧光探针的应用，HQO在559nm激光激发的条件下，可以特定的定位在生理学pH的线粒体。当损伤的线粒体和溶酶体融合的时候，由于新产生的自噬溶酶体的pH降低，使得HQO质子化，导致分子的激发波长红移，可以在635nm-710nm激光的激发下定位在自噬溶酶体。

本发明提供的HQO(2,6-Bi(2-(3,3-dimethyl-1-propylindolin-2-ylidene)ethylidene)-cyclohexanone)在作为或制备具有下述1)-3)中任一项功能的荧光探针中的应用，

1)特异性标记活细胞中的线粒体自噬溶酶体；

2)同时标记活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体；

3)监测活细胞中线粒体自噬过程；

其中，HQO的结构式如式Ⅰ所示：

上述的应用中，所述活细胞可为癌细胞，具体可为乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa或结肠癌细胞LoVo。

本发明进一步提供了式Ⅰ所示的HQO的试剂盒在作为或制备具有下述1)-3)中任一项功能的荧光探针中的应用，

1)特异性标记活细胞中的线粒体自噬溶酶体；

2)同时标记活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体；

3)监测活细胞中线粒体自噬过程；

所述试剂盒包括式Ⅰ所示化合物和溶剂；式Ⅰ所示化合物的浓度可为0.01～100mM(如1mM)；所述溶剂可为PBS缓冲液、细胞培养基(如1640和/DMEM)或二甲基亚砜。

上述的应用中，所述活细胞可为癌细胞，具体可为乳腺癌细胞MCF-7、肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa或结肠癌细胞LoVo。

本发明具有如下有益效果：

本发明克服了现有技术中需要同时使用两种荧光染料分别染色线粒体和溶酶体来监测活细胞中线粒体自噬过程的缺陷，采用式Ⅰ所示HQO可特异性的只染色源自损伤线粒体的自噬溶酶体，且可同时定位活细胞中线粒体和线粒体自噬溶酶体，从而应用于监测活细胞中线粒体自噬过程。

附图说明

图1为采用IR780合成HQO的线路图。

图2(a)为HQO在不同酸性环境中的吸收光谱谱图，图2(b)为对应的结构变化图。

图3为HQO在DMSO中的核磁滴定氢谱。