[发明专利]一种发酵培养基及用该发酵培养基发酵NMN转移酶的方法在审
申请号: | 201610268173.0 | 申请日: | 2016-04-27 |
公开(公告)号: | CN105695429A | 公开(公告)日: | 2016-06-22 |
发明(设计)人: | 李红梅;段琳琳;袁飞飞;亢涵 | 申请(专利权)人: | 上海理工大学 |
主分类号: | C12N9/12 | 分类号: | C12N9/12;C12R1/19 |
代理公司: | 上海德昭知识产权代理有限公司 31204 | 代理人: | 郁旦蓉 |
地址: | 200093 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 发酵 培养基 nmn 转移酶 方法 | ||
1.一种发酵培养基,其特征在于,包含:
浓度为20~30g/L的酵母粉,浓度为8~12g/L的胰蛋白胨,体积分数为3%~4.5%的甘油,浓度为0.2~0.3g/L的MgSO4,酵母膏,浓度为1.0~1.5g/L的NH4Cl,浓度为0.4~0.6g/L的NaCl,浓度为2~3g/L的KH2PO4,浓度为9~13.5g/L的K2HPO4以及双蒸水。
2.一种烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵方法,利用权利要求1所述的发酵培养基进行发酵,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,将大肠杆菌划线接种到固体培养基上,在35~45℃的条件下培养12~18h,得到含有大肠杆菌的固体培养基;
步骤二,取一定量的LB培养基溶于双蒸水中,调节其pH值为6.0~8.0,在121℃条件下灭菌15~30min,得到浓度为20~30g/L的活化液;
步骤三,在无菌环境下从所述固体培养基上挑取大肠杆菌接种到所述活化液中,并加入终浓度为20~40μg/ml的硫酸卡那霉素,在35~45℃条件下活化8~12h,得到含有活化的大肠杆菌菌体的液体;
步骤四,将所述含有活化的大肠杆菌菌体的液体按照体积分数为1~5%的接种量接入经过灭菌的所述发酵培养基中,在温度为35~45℃,摇床转速为180~200r/min的条件下,发酵培养至OD600为0.5~0.7时,加入终浓度为5~10mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),在温度为20~30℃,摇床转速为150~200r/min条件下,诱导培养8~12h,收集得到含烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵液;
步骤五,将所述发酵液放置于离心管中,在8000~12000r/min条件下离心5~10min,取离心管内的沉淀得到含有烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的大肠杆菌湿菌体。
3.根据权利要求2所述的烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵方法,其特征在于:
其中,在步骤一中,所述固体培养基的制备方法为:将浓度为25g/L的LB培养基和浓度为20g/L的琼脂用双蒸水溶解于500ml的锥形瓶中,加入NaOH调节pH为7.0,在121℃条件下高压灭菌20min,得到所述固体培养基。
4.根据权利要求2所述的烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵方法,其特征在于,还包括:
其中,对所述大肠杆菌湿菌体中的烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的酶活进行测定的步骤,该步骤包括以下子步骤:
子步骤一,将大肠杆菌湿菌体用浓度为50mmol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲溶液重悬,超声破碎所述大肠杆菌湿菌体,破壁后的菌液在温度为4℃、转速为12000r/min离心20min,收集所述菌液的上清液,所述菌液的上清液即为粗酶液;
子步骤二,将浓度为1mol/LpH7.5Tris-HCl的缓冲液、浓度为300mmol/L的NMN转移酶、浓度为50mmol/L的ATP、浓度为50mmol/L的Mn2+、体积分数为2%的乙醇、体积分数为53%的所述粗酶液以及酶量为7U的乙醇脱氢酶(ADH)混匀,得到混合溶液;
子步骤三,将所述混合溶液置于37℃的恒温水浴锅中振荡反应2h,加入浓度为0.155mol/L的EDTA反应5min,终止酶反应,冰浴冷却后在转速8000r/min条件下离心1min,取所述混合溶液的上清液并在340nm处测定反应产物的吸光值OD340,所述吸光值OD340代表NMN转移酶酶活力大小。
5.根据权利要求4所述的烟酰胺单核苷酸腺苷(NMN)转移酶的发酵方法,其特征在于:
其中,在子步骤三中,所述超声破碎的条件为功率为300W,超声时间4s,每次间隔6s,超声次数60次。
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